[发明专利]一种亮氨酸氨肽酶3抑制剂的抑酶活性测定方法及应用

说明书

本发明提供一种测定化合物对亮氨酸氨肽酶3活性抑制率的方法，以表达人源LAP3的K562‑LAP3细胞株作为酶源进行化合物抑酶活性测定。本发明还提供一种能够测定化合物对亮氨酸氨肽酶3活性抑制率的试剂盒，该试剂盒采用上述方法进行测定。本发明技术方案采用人源的LAP3作为酶源进行化合物抑制活性效果评价，准确率高于现有技术中采用猪源亮氨酸氨肽酶的检测方法，且成本更为经济，结果更准确。

技术领域

本发明涉及化合物抑酶活性测定领域，具体涉及一种亮氨酸氨肽酶3抑制剂的抑酶活性测定方法、酶源制备方法及其应用。

背景技术

亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase，LAP)是一种蛋白分解酶，能水解肽链N端并由亮氨酸与其他氨基酸形成肽键的酶，广泛分布于肝、胰、肾等组织中。当人体肝、胆、胰等组织有病变时，均可出现血清LAP水平升高。测定血清亮氨酸氨基转肽酶可作为肝病诊断的又一项指标，对淤胆性肝炎的鉴别诊断、肝道梗阻及胰腺癌的诊断有价值。肝内外胆淤时，LAP活力显著增高，尤其在恶性胆淤时，其活力随病情进展而持续增高。亮氨酸氨基肽酶(LAP)的检测也可早期反映肾损害的性质和程度，并为临床鉴别肾小球、肾小管损伤提供可能的帮助；其亦可作为妊娠合并ICP及孕妇和胎儿健康情况动态监测的一项有效指标。

红白血病K562细胞是第一个人类髓性白血病人工培养的细胞，是源自一个53岁的女性慢性髓性白血病爆发期病人的淋巴母细胞。用于研究肿瘤和白血病治疗、药物靶标等领域。

酶活性测定方法有多种，由于酶具有高度的专一催化活性，故可通过测定其相应的底物或产物的浓度变化，或用某一反应产物浓度变化来确定其酶的活性。例如还原法、发色底物法、粘度法、高压液相色谱法、免疫学方法、琼脂凝胶扩散法等。一般采用电化学和光物理的方法，即利用反应物或产物的吸光性，用紫外分光光度法或荧光法测定。若酶反应过程中产物或反应物有气体，则可用测压仪(瓦氏呼吸仪)测定。若反应过程中生成酸，则可用电化学法。用同位素标记的底物则可用放射化学法测定底物浓度变化，计算酶活性。一些性质稳定的酶，也可用高效液相色谱法检测。而现有技术中关于化合物抑制亮氨酸氨肽酶3酶活的手段并不成熟，尚未有技术成熟、方便购买的试剂盒产品，为科研工作带来诸多不便。

慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。本发明所采用的慢病毒(Lentivirus)为“自杀”性病毒，其毒性基因已被剔除并被外源性目的基因所取代，不具有感染目的细胞后再感染其他细胞的能力，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，属于假型病毒。该慢病毒(LV-LAP3)由上海吉凯基因化学技术有限公司构建、包装和纯化。

发明内容

本发明目的在于提供一种成本经济、操作简单的测定靶向亮氨酸氨肽酶3的化合物的抑酶活性方法。现有技术的酶活测定试剂盒中提供的酶标准品多为从猪肾小体中提取的亮氨酸氨肽酶，与人源的亮氨酸氨肽酶3相比存在较大差异，且价格昂贵。本发明通过构建一种稳定表达人源亮氨酸氨肽酶3的细胞株，用于测定化合物对蛋白酶活的抑制活性，相比现有技术中使用非人源的亮氨酸氨肽酶3作为评价的工具，本发明的方法测得的抑酶活性数据更加可靠。

本发明目的之一在于提供一种测定化合物对亮氨酸氨肽酶3活性抑制率的方法，该方法特征在于，以能够稳定表达人源LAP3的K562-LAP3细胞株作为酶源进行化合物抑酶活性的测定。

上述测定化合物对亮氨酸氨肽酶3活性抑制率的方法，步骤如下：

(1)将PBS清洗后的K562-LAP3细胞接种于96孔板中；

(2)向孔中加入不同浓度梯度的化合物；

(3)化合物作用一段时间后加入LAP3底物培养；

(4)测定405nm处的吸光度值，计算抑制率：