[发明专利]一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法

权利要求书

1.一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)诱导型病毒侵染性克隆的构建：所述表达载体包含农杆菌T-DNA左边界序列、农杆菌T-DNA右边界序列、诱导型启动子、植物正义RNA病毒全长cDNA、真核转录终止子、大肠杆菌和农杆菌复制必需元件和抗性筛选基因，其中，植物正义RNA病毒全长cDNA位于诱导型启动子和真核转录终止子序列之间，农杆菌T-DNA右边界序列位于诱导型启动子上游，农杆菌T-DNA左边界序列位于真核转录终止子下游；获得的诱导型病毒侵染性克隆转化大肠杆菌宿主菌中，获得阳性转化子；

2)诱导型病毒侵染性克隆的遗传转化：将步骤1)获得的阳性转化子导入农杆菌，然后将诱导型病毒侵染性克隆转入植物体内，获得转基因植物；

3)植物病毒复制必需基因的大通量筛选：用转基因植物构建突变体库，突变体发芽后，利用诱导剂诱导病毒侵染，进行突变体的筛选，得到病毒不能被诱导的突变体植物，结合图位克隆和全基因组测序的方法确定筛选的植物病毒复制必需基因。

2.根据权利要求1所述的一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，其特征在于，所述大肠杆菌的宿主菌为大肠杆菌Trans10，所述农杆菌为农杆菌GV3101。

3.根据权利要求1所述的一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，其特征在于，所述农杆菌T-DNA左边界序列如SEQ ID NO:1所示；所述农杆菌T-DNA右边界序列如SEQ ID NO:2所示；所述的大肠杆菌和农杆菌复制必需元件的序列如SEQ ID NO:3所示。

4.根据权利要求1所述的一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，其特征在于，步骤1)所述植物正义RNA病毒为马铃薯Y病毒属病毒或马铃薯X病毒属病毒；所述的马铃薯Y病毒属病毒包括芜菁花叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、李痘病毒、番木瓜环斑病毒、大豆花叶病毒和烟草蚀纹病毒；所述的马铃薯X病毒属病毒包括马铃薯X病毒、马铃薯奥古巴花叶病毒、凤果花叶病毒、车前草花叶病毒和狐尾草花叶病毒。

5.根据权利要求4所述的一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，其特征在于，步骤1)所述植物正义RNA病毒全长cDNA为芜菁花叶病毒的全长cDNA，其序列如SEQ IDNO:4所示。

6.根据权利要求4所述的一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，其特征在于，步骤1)所述植物正义RNA病毒全长cDNA为马铃薯X病毒的全长cDNA，其序列如SEQ IDNO:5所示。

7.根据权利要求1所述的一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，其特征在于，步骤1)所述的诱导型启动子为雌激素诱导型启动子XVE，其序列如SEQ ID NO:6所示。

8.根据权利要求7所述的一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，其特征在于，步骤1)所述抗性筛选基因为潮霉素基因，序列如SEQ ID NO:7所示，所述潮霉素基因，其上游为雌激素诱导型启动子XVE-1，其序列如SEQ ID NO:8所示，其下游为雌激素诱导型启动子XVE-2，其序列如SEQ ID NO:9所示。

9.根据权利要求8所述的一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，其特征在于，步骤1)所述的植物正义RNA病毒全长cDNA，其上游的启动子为雌激素诱导型启动子XVE-2。

10.根据权利要求1所述的一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，其特征在于，步骤1)所述真核转录终止子为T3A终止子，其序列如SEQ ID NO:10所示。