[发明专利]一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法

说明书

一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，属于基因工程技术领域。本发明针对目前侵染性克隆构建方法中病毒侵染效率低，基因表达难控制的问题，本发明提供了一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，具体是利用诱导型启动子构建诱导型病毒侵染性克隆，通过农杆菌介导转化植物，用转基因植物构建突变体库，待突变体发芽后，利用诱导剂诱导病毒侵染，进行突变体的筛选，得到病毒不能被诱导的突变体植物，再结合图位克隆和全基因组测序的方法定位并克隆植物病毒复制必需寄主基因，本发明适用于一次性大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法。

背景技术

植物正义RNA病毒的RNA具有侵染性，进入植物细胞后可作为mRNA被细胞的核糖体翻译产生病毒复制所需要的蛋白质(Flasinski et al.,1996)，进而启动病毒的复制、运动等生命过程。植物正义RNA病毒可以通过构建侵染性克隆以方便长期保存，进行改造(Flasinski et al.,1996,Takahashi et al.,1997)。目前有许多植物正义RNA病毒的侵染性克隆被报道，总结方法可以归为两类：1)将病毒的全基因组的cDNA插入至组成型启动子，如花棷菜花叶病毒(CaMV)35S启动子下游，通过农杆菌在植物中表达病毒基因组RNA；2)将病毒的全基因组的cDNA插入至原核转录启动子(如SP6和T7)下游，通过体外转录获得病毒全基因组RNA，然后通过机械摩擦接种植物。上述两种方法存在着以下缺陷：1)组成型启动子一旦进入细胞即开始表达，因此不能条件性地控制表达的时间；2)由于RNA的自然特征，原核转录启动子转录过程产生的病毒RNA非常容易被环境中RNA酶降解，造成病毒侵染效率低下。

筛选一种植物病毒复制必需寄主基因需要构建一个可以理论上可以覆盖植物基因组所有基因的突变体库，然后通过逐一接种病毒，筛选病毒不能复制的突变体获得。这种方法存在一个明显的缺陷，即需要大量种植突变体至一定株高并逐一进行病毒接种，需要非常大的人力、速度慢、温室以及实验材料。

发明内容

针对目前侵染性克隆构建方法中病毒侵染效率低，基因表达难控制的问题，本发明提供了一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，包括如下步骤：

1)诱导型病毒侵染性克隆的构建：所述表达载体包含农杆菌T-DNA左边界序列、农杆菌T-DNA右边界序列、诱导型启动子、植物正义RNA病毒全长cDNA、真核转录终止子、大肠杆菌和农杆菌复制必需元件和抗性筛选基因，其中，植物正义RNA病毒全长cDNA位于诱导型启动子和真核转录终止子序列之间，农杆菌T-DNA右边界序列位于诱导型启动子上游，农杆菌T-DNA左边界序列位于真核转录终止子下游；获得的诱导型病毒侵染性克隆转化大肠杆菌宿主菌中，获得阳性转化子；

2)诱导型病毒侵染性克隆的遗传转化：将步骤1)获得的阳性转化子导入农杆菌，然后将诱导型病毒侵染性克隆转入植物体内，获得转基因植物；

3)植物病毒复制必需基因的大通量筛选：用转基因植物构建突变体库，突变体发芽后，利用诱导剂诱导病毒侵染，进行突变体的筛选，得到病毒不能被诱导的突变体植物，结合图位克隆和全基因组测序的方法确定筛选的植物病毒复制必需基因。

优选地，所述大肠杆菌的宿主菌为大肠杆菌Trans10，所述农杆菌为农杆菌GV3101。

优选地，所述农杆菌T-DNA左边界序列如SEQ ID NO:1所示；所述农杆菌T-DNA右边界序列如SEQ ID NO:2所示；所述的大肠杆菌和农杆菌复制必需元件的序列如SEQ ID NO:3所示。