[发明专利]递送融合型RNA结合蛋白的表达载体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种递送融合型RNA结合蛋白的表达载体，包括引导蛋白序列和RNA结合蛋白序列；引导蛋白为能够定位于外泌体和/或溶酶体的引导蛋白；RNA结合蛋白序列包括RNA结合蛋白全序列或RNA结合蛋白结构域序列。并提供一种所述载体的制备方法。还设计一种含所述的递送融合型RNA结合蛋白的表达载体的外泌体，其制备方法为：将所述载体与包装质粒一起共转染HEK293T细胞包装病毒，随后将病毒感染外泌体包装细胞，收集外泌体即得。将上述表达载体或外泌体在药物递送载体和RNA调控的相关疾病治疗中应用。本发明选取外泌体作为递送RNA结合蛋白的手段，创建了一种高效的递送改造的融合型RNA结合蛋白的方法。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种递送融合型RNA结合蛋白的表达载体及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白类药物在医药领域中的比重越来越大，靶向递送蛋白类药物，特别是在组织和细胞类的蛋白药物，是整个蛋白类药物应用最为重要的环节。

目前，蛋白类药物的递送手段包括：通过蛋白融合穿膜肽解决跨细胞递送的问题，利用微球或水凝胶解决蛋白质缓释的问题，通过靶向型纳米颗粒或纳米凝胶解决组织和细胞靶向性问题。然而，这些手段机制复杂，不易调控。

近年来，外泌体作为细胞间蛋白和核酸信息分子传递的手段，得到越来越多的重视。外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。然而，但如何利用外泌体干预内源蛋白，目前缺乏理想策略。

RNA结合蛋白通过转录后调控方式调节基因表达，其中有相当比例通过增加mRNA稳定性和翻译效率，促进基因表达，在多种疾病中扮演重要角色。这类RNA结合蛋白是理想的药物靶点，但递送手段和干预手段非常有限，如何靶向干预其功能成为瓶颈问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种递送融合型RNA结合蛋白的表达载体及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

设计一种递送融合型RNA结合蛋白的表达载体，所述表达载体包括融合蛋白序列和RNA结合蛋白序列；所述融合蛋白为能够定位于外泌体和/或溶酶体的引导蛋白；所述RNA结合蛋白序列包括RNA结合蛋白全序列或RNA结合蛋白结构域序列。

优选的，所述融合蛋白为溶酶体相关膜蛋白。

优选的，所述RNA结合蛋白为人抗原R(HuR)。

提供一种所述递送融合型RNA结合蛋白的表达载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)Trizol提取小鼠成纤维细胞总RNA；

(2)利用Promega M-MLV反转录酶对RNA进行反转录得小鼠成纤维细胞cDNA；

(3)以反转录cDNA为模板，扩增融合蛋白和RNA结合蛋白目的条带；

(4)将目的条带用限制性内切酶酶切连入表达载体，即得。

设计一种含所述的递送融合型RNA结合蛋白的表达载体的外泌体，其制备方法为：将所述载体与包装质粒一起共转染HEK293T细胞包装病毒，即得能够产生该融合蛋白的病毒；将该病毒感染外泌体包装细胞，如间充质干细胞MSCs,收集感染细胞分泌的外泌体，即可获得目标外泌体。

优选的，所述包装质粒为psPAX2和/或pMD2.G。

将上述表达载体或外泌体在药物递送载体中应用。

将上述表达载体或外泌体在RNA调控的相关疾病治疗中应用。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：