[发明专利]一种靶向外泌体进行基因载药的载体及其构建方法及应用

权利要求书

1.一种靶向外泌体进行基因载药的载体，其特征在于，包括CMV7启动子、选择性的标记Puromycin、抗性基因以及病毒载体骨架PLVX-CMV7-MCS-EF1-Puro；在所述CMV7启动子和选择性的标记Puromycin 之间的多克隆位点处加上如SEQ ID NO.1所示的EGFP-F5/8 typeC序列。

2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述抗性基因为氨苄青霉素抗性基因。

3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体还包括多克隆位点MCS，该多克隆位点MCS用于插入荧光或其他蛋白质、靶向小分子。

4.如权利要求1-3任一项所述的载体的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

第一步，合成目的基因Retinoschisin的F5/8 typeC的区域，即Retinoschisin基因编码的第59-244氨基酸；第一步具体为：（1）根据GenBank中人MFGE8的mRNA上CDS序列、人RS1的mRNA上CDS序列、EGFP标签蛋白序列、linker标签序列的基因信息，设计EcoRI-MFGE8-EGFP-linker-RS1-XhoI基因DNA片段，合成如SEQ ID NO.1所示的双链DNA分子；所述EcoRI-MFGE8- EGFP-linker-RS1-XhoI基因DNA片段中，MFGE8为MFGE8基因编码的第1-23氨基酸，RS1为RS1基因编码的第59-224氨基酸；

（2）分别用合成的引物，如SEQ ID NO.2所示的PSE2705-F和如SEQ ID NO.3所示的PSE2705-R来PCR步骤（1）合成的双链DNA分子，得到PCR产物；

第二步，将该基因构建至病毒载体PLVX-CMV7-MCS-EF1-Puro中。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，第二步具体为：

1）用限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切病毒载体PLVX -CMV7-MCS-EF1-Puro，回收载体骨架；

2）将步骤(2)的PCR产物和步骤1)的载体骨架重组，转化进大肠杆菌，筛选阳性菌并提取其质粒，得到重组载体。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR 的体系按照32.5µl H₂O，10µl 5×Buffer 含有Mg²⁺的缓冲液，4µl dNTP，1µl 正向引物Primer1，1µl 反向引物Primer2，1µl 目的基因模板DNA，以及0.5µl 的PrimeSTAR酶，组成反应体系；

所述PCR程序如下：98℃，变性3分钟；退火98℃10秒，55℃15秒，72℃1分钟，重复30个循环；延伸72℃ 10分钟。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述酶切体系为： EcoRI:1μL，XhoI:1μL，缓冲液:3μL，PLVX -CMV7-MCS-EF1-Puro质粒:1μg，补充水至30μL；37℃酶切4小时。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述重组体系为：重组酶:15μL，回收的PCR产物DNA:40ng，回收的质粒:20ng；42℃水浴30min后，转化进大肠杆菌。

9.一种如权利要求1-3任一项所述的载体在制备靶向外泌体进行基因药物递送的产品中的应用。