[发明专利]一种靶向外泌体进行基因载药的载体及其构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种靶向外泌体进行基因载药的载体，包括CMV7启动子、选择性的标记Puromycin、抗性基因；在所述CMV7启动子和选择性的标记Puromycin之间的多克隆位点处加上如SEQ ID NO.1所示的EGFP‑F5/8 typeC序列。此外，本发明还公开了该载体的构建方法和应用。本发明载体使得外泌体能够最大限度携带外源基因，进行基因药物的递送。本发明载体的基因序列较小，能够增加携带基因的容量，拓宽了外源基因的选择余地。本发明载体的荧光效果更强，能够明显且直观的观察。

技术领域

本发明属于基因工程和生物技术领域，尤其涉及一种载体，具体涉及一种靶向外泌体进行基因载药的载体；此外，本发明还涉及该载体的构建方法和应用。

背景技术

外泌体是细胞分泌的细胞外囊泡，人体几乎所有细胞均可产生外泌体，如B细胞，T细胞，血细胞、肿瘤细胞等，且外泌体存在于所有的体液中，如尿液、血液、脑脊液等。外泌体直径大约在30nm到100nm之间。外泌体其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。

外泌体包含的各种物质均来源于其细胞，如蛋白质，RNA，双链DNA，代谢分子。由于外泌体的体积非常小，这点优势使得他们可以逃避机体内的单核吞噬细胞系统的吞噬作用，并且可以穿过血管内皮细胞，到达下游的目的细胞。另外，还有研究发现外泌体甚至可以通过血脑屏障、胎盘屏障等。此外，外泌体具有生物来源的特点，使得其免疫原性比较低。外泌体可通过和其他细胞的细胞膜进行融合，发生内吞，从而将外泌体的内容物释放到下游细胞中来发挥作用，也可以通过细胞膜表面受体相互作用与靶细胞进行交流，将内含物释放至靶细胞中，运用此类方法，可以减少基因药物的降解，逃避溶酶体途径。

传统的药物递送载体有病毒载体，纳米材料等。病毒载体虽然已有作为基因药物的运载工具，且有临床试验成功的先例，然而由于病毒载体会整合至整个基因组中以及突变回野生型病毒的风险存在，使得病毒载体在应用受到限制。纳米材料如脂质体，纳米颗粒等越来越多的应用于药物递送系统中，但是仍然存在生物相容性低，稳定性差等缺点，因此，外泌体作为一种细胞分泌的囊泡，是作为基因药物递送载体的最佳选择。

存在的问题：目前，选用最多的是将外泌体的标志物即四跨膜蛋白CD63，CD81，CD9作为引导，将其他目的基因或者荧光蛋白，与标志物蛋白进行融合表达，从而将表达的外源基因引导带至外泌体中。然而，运用类似此类标志物有以下几个弊端：第一就是自身基因较大，受载体限制，使得外源基因的选择余地比较小；其次，此类标志物蛋白靶向性比较差，在细胞器膜上，同样也富含此类蛋白，所以导致转化率比较小，效率较低。另外，CD63，CD9，CD81被视为细胞功能的重要蛋白，利用此类蛋白做引导，势必会影响细胞或者是外泌体的功能。

因此，开发能够有效且有特异性，且不影响细胞、外泌体功能的具有靶向外泌体的载体就成为需要迫切解决的一个技术问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种可以靶向外泌体进行基因载药的载体，通过使用分泌蛋白Retinoschisin的F5/8 typeC的区域，即Retinoschisin基因的第59-244氨基酸，能够使得连接的蛋白质能够特异引导到细胞外囊泡的膜上，从而使外源的基因物能够包裹进外泌体中，由于使用的是肽段，使得外泌体能够最大限度携带外源基因，进行基因药物的递送。

本发明要解决的技术问题之二是提供该载体的构建方法。

本发明要解决的技术问题之三是提供该载体的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：