[发明专利]一种sgRNA的体外合成方法及其试剂盒有效
| 申请号： | 201810634615.8 | 申请日： | 2018-06-20 |
| 公开（公告）号： | CN108330138B | 公开（公告）日： | 2018-09-25 |
| 发明（设计）人： | 朱化星;张清仪;石加加;赵曼曼;何翼 | 申请（专利权）人： | 上海欣百诺生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/63 | 分类号： | C12N15/63;C12N15/10;C12N15/113;C12N9/22 |
| 代理公司： | 上海一平知识产权代理有限公司 31266 | 代理人： | 王正君;徐迅 |
| 地址： | 201203 上海市浦东新区中国（*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 连接序列 体外合成 试剂盒 核酸构建物 核苷酸序列 靶DNA序列 合成体系 下游引物 核苷酸 结合区 启动区 合成 | ||
1.一种sgRNA合成体系，其特征在于，所述的sgRNA合成体系是sgRNA体外一步转录合成反应的合成体系，并且所述体系包括：
(a)核酸构建物，所述核酸构建物具有5’-3’的式I所示的结构：
Y1-L1-Y2-L2-Y3-Y4 (I)
其中，
Y1为RNA聚合酶启动区；
L1为无或连接序列；
Y2为靶DNA序列；
L2为无或连接序列；
Y3为下游引物结合区；
Y4为无或核苷酸序列；
并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
(b)下游引物；
(c)DNA聚合酶；和
(d)RNA聚合酶；
其中,所述元件Y3的长度为5-30bp。
2.如权利要求1所述的sgRNA合成体系，其特征在于，所述RNA聚合酶选自下组：T7RNA聚合酶、Sp6RNA聚合酶、U6RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、或其组合。
3.如权利要求1所述的sgRNA合成体系，其特征在于，所述L2和/或Y3中的一部分或全部可作为barcode序列使用。
4.如权利要求1所述的sgRNA合成体系，其特征在于，所述L2为barcode序列。
5.如权利要求1所述的sgRNA合成体系，其特征在于，所述Y3为通用引物结合区。
6.如权利要求1所述的sgRNA合成体系，其特征在于，所述元件Y1的序列结构为：NX-TAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO.:1的第2-18位)-GY，其中N为A、T、C或G，X为1-6的整数，Y为0-2的整数。
7.如权利要求1所述的sgRNA合成体系，其特征在于，所述sgRNA合成体系还包括选自下组的一种或多种组分：
(e)DTT；
(f)亚精胺；
(g)甘油；
(h)无RNA酶的水；
(i)Triton-X100；
(j)RNA酶抑制剂；
(k)硫酸铵；
(l)吐温20
(m)用于合成RNA的底物；
(n)用于合成DNA的底物；
(o)镁离子；
(p)缓冲剂。
8.一种体外合成sgRNA的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)提供权利要求1-7中任一权利要求所述的sgRNA合成体系；
(ii)在适合的条件下，孵育步骤(i)的合成体系一段时间T1，从而合成所述的sgRNA。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：(iii)从所述sgRNA合成体系中，分离或检测所述的sgRNA。
10.一种用于sgRNA合成的试剂盒，其特征在于，包括：
(k1)第一容器，以及位于第一容器内的核酸构建物，所述核酸构建物具有5’-3’的式I所示的结构：
Y1-L1-Y2-L2-Y3-Y4 (I)
其中，
Y1为RNA聚合酶启动区；
L1为无或连接序列；
Y2为靶DNA序列；
L2为无或连接序列；
Y3为下游引物结合区；
Y4为无或核苷酸序列；
并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
其中,所述元件Y3的长度为5-30bp；
(k2)第二容器，以及位于第二容器内的下游引物；和
(kt)标签或说明书。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述元件Y1的长度为17-40bp；所述元件Y4的长度为5-30bp；和所述连接序列的长度为1-30nt。
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