[发明专利]一种sgRNA的体外合成方法及其试剂盒

说明书

本发明提供了一种sgRNA的体外合成方法及其试剂盒，具体地，本发明提供了具有5’‑3’的式I所示的结构的核酸构建物：Y1‑L1‑Y2‑L2‑Y3‑Y4 (I)，其中，Y1为RNA聚合酶启动区；L1为无或连接序列；Y2为靶DNA序列；L2为无或连接序列；Y3为下游引物结合区；Y4为无或核苷酸序列；并且，各“‑”独立地为键或核苷酸连接序列。本发明的sgRNA合成体系可显著提高sgRNA的合成产量，并且可以将整个流程时间大幅缩短，步骤简便，平均费用也大大下降。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种sgRNA的体外合成方法及其试剂盒。

背景技术

CRISPR(clustered regularly interspaced short palin-dromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是一些细菌及古细菌中特有的获得性免疫系统，这个系统通过特定序列的RNA引导，特异性切割降解外源性DNA。CRISPR/Cas系统可分为三种类型,其中II型CRISPR/Cas系统由于其组成简单，被改造成为基因组靶向编辑的工具。而通过人工设计并在体外转录RNA，可以合成具有引导作用的sgRNA(single guide RNA)，sgRNA引导Cas蛋白特异性切割目的DNA序列。通过对Cas蛋白的改造，在sgRNA的引导下，CRISPR/Cas系统在研究中可以达成多种目的，比如对基因进行切割、修饰、沉默、敲除、调整表达等操作。CRISPR/Cas已经成为基因编辑和研究的有力工具，具有十分光明而广泛的应用前景。

作为CRISPR/Cas系统中不可或缺的sgRNA，其合成方法非常重要，如何以较低的成本获得可用的sgRNA成为科研工作者的关注目标。化学合成RNA法时间周期为7～14天，而且费用很高，不适合sgRNA合成。构建质粒载体在体内转录RNA的方法需要繁琐费时的载体构建工作，而且不够灵活，每个载体只能对应少量特定的RNA。

而目前传统的sgRNA体外转录法有很多繁琐的步骤，通常是1、PCR扩增模板DNA，2、胶回收PCR产物，3、将PCR产物作为模板转录sgRNA。其操作费时费力，整个流程需要5～6小时。其间需要使用PCR仪、电泳槽、离心机等多种仪器，涉及的试剂有PCR 扩增酶、胶回收试剂盒、T₇RNA酶等，因此平均费用不低。

因此本领域迫切地需要开放一种简单、方便、省时、高效又节省的sgRNA体外合成方法。

发明内容

本发明提供了一种简单、方便、省时、高效又节省的sgRNA体外合成方法。

本发明第一方面提供了一种sgRNA合成体系，包括：

(a)核酸构建物，所述核酸构建物具有5’-3’的式I所示的结构：

Y1-L1-Y2-L2-Y3-Y4 (I)

其中，

Y1为RNA聚合酶启动区；

L1为无或连接序列；

Y2为靶DNA序列；

L2为无或连接序列；

Y3为下游引物结合区；

Y4为无或核苷酸序列；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

(b) 下游引物；

(c) DNA聚合酶；和

(d) RNA聚合酶。

在另一优选例中，所述RNA聚合酶选自下组：T7 RNA聚合酶、Sp6 RNA聚合酶、U6RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、或其组合。