[发明专利]通用型靶向CD19抗原嵌合受体T细胞的制备及其应用

权利要求书

1.一种制备靶向CD19抗原嵌合受体T细胞的方法，所述方法包括将基因编辑物质递送至T细胞以剪切TRAC和B2M基因；和

将靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E融合基因克隆至修复模板载体中以同时向T细胞导入靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E融合基因同源重组修复模板，其中所述B2M-HLA-E融合基因的DNA序列如SEQ ID NO: 35所示，

其中所述基因编辑物质包括CRISPR-Cas9，递送方式使用SpCas9 mRNA和修饰的sgRNA，其中靶向TRAC基因的sgRNA序列如SEQ ID NO: 4所示，靶向B2M基因的sgRNA序列如SEQ IDNO: 5所示，sgRNA的修饰方式为5’和3’端各三个碱基同时进行2’-O-甲基化和3’硫代磷酸化修饰。

2. 根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：

从健康受试者血中提取PBMC并激活T细胞；和/或

T细胞培养扩增，收集TCR或CD3阴性细胞。

3. 根据权利要求1所述的方法，其中SpCas9的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示, 其中SpCas9 mRNA含有入核信号。

4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述入核信号包括SV40 NLS和核质蛋白NLS，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述修复模版载体包括腺相关病毒、非整合型慢病毒、单链DNA、双链DNA、质粒DNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述修复模版载体为腺相关病毒载体，其中腺相关病毒载体的血清型包括：1、2、3、4、5、6、7、8、9、DJ。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述血清型为血清型6。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述修复模版载体的核心序列从5’到3’端依次包括同源序列左臂、敲入基因、同源序列右臂。

9. 根据权利要求8所述方法，其中靶向CD19 CAR基因修复模版同源臂的长度为300-1200bp，和/或B2M-HLA-E融合基因同源臂的长度为300-1200bp。

10. 根据权利要求1所述的方法，其中敲入的基因包括以下元件或其组合：剪切肽、靶向CD19 CAR、Poly A。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述剪切肽是T2A、P2A或IRES。

12. 根据权利要求10所述的方法，其中所述Poly A包括BGHpA。

13. 根据权利要求10所述的方法，其中所述靶向CD19 CAR包含信号肽、靶向CD19抗体scFv、铰链区、跨膜区、一个或两个共刺激信号区、信号传导区。

14. 根据权利要求13所述的方法，其中靶向CD19 CAR的跨膜结构选自以下蛋白：CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和PD1。

15. 根据权利要求14所述的方法，其中靶向CD19 CAR的跨膜结构选自CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示。

16. 根据权利要求13所述的方法，其中靶向CD19 CAR的铰链结构选自以下蛋白：IgG1、IgG4、IgD或CD8。