[发明专利]抗人乳头瘤病毒小分子抗体及其组合物以及制备方法和应用

权利要求书

1.一种抗人乳头瘤病毒小分子抗体，其特征在于，所述抗人乳头瘤病毒小分子抗体由如下方法制备得到：

A、制备抗原：在人乳头瘤病毒多肽中加入弗氏佐剂，并置于高速匀浆器中高速匀化，得到免疫用的人乳头瘤病毒多肽抗原；

B、制备免疫蛋：每隔两周对产蛋鸡注射一次免疫用的人乳头瘤病毒多肽抗原，注射2-5次，最后一次注射后的至少第12天后取产蛋鸡所产免疫蛋，并进行编码标记，得到抗人乳头瘤病毒-IgY免疫蛋；

C、制备抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物；

D、制备抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液；

E、制备抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab：将抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液调节pH至3.0-5.0，加入催化蛋白质酶；充分搅拌溶解，产生酶促反应，然后低温高速旋转离心，弃去沉淀得上清液，对上清液进行超滤，得到浓缩液；再将超滤后所获浓缩液进行凝胶层析，将层析收集物透析浓缩，得到抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab。

2.根据权利要求1所述的抗人乳头瘤病毒小分子抗体，其特征在于，步骤E制备得到的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab还利用聚乙二醇、右旋糖苷或聚氨基酸长效化修饰，得到长效化的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab。

3.根据权利要求2所述的抗人乳头瘤病毒小分子抗体，其特征在于，步骤E制备得到的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab利用聚乙二醇进行长效化修饰，且利用聚乙二醇长效化修饰的工艺条件如下：

调节硼酸缓冲液pH值至6.5-10.0，在抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab中加入调节pH后的硼酸缓冲液，使抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab的浓度为0.1-0.5mg/mL，加入聚乙二醇进行反应，且抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab与聚乙二醇的摩尔比的比值为1/10～1/30，反应温度为15℃～30℃，反应时间控制在1h～3h。

4.根据权利要求1所述的抗人乳头瘤病毒小分子抗体，其特征在于，步骤E得到的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab还通过被干燥得到粉末状的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab；

粉末状的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab还被天然来源的CPPs或人工合成的CPPs偶联得到渗透细胞膜能力强的偶联的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab，其中偶联的方法包括：

取如下质量份数的粉末状的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab干粉1-3份、CPPs-EGFP1-3份、BSA-NS蛋白微球5-10份，分别溶于各自的pH7.5、0.01mol/L的PBS，得到浓度为0.5-1.5g/L的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab溶液、浓度为0.5-1.5g/L的CPPs-EGFP溶液、浓度为2.5-5g/L的蛋白微球溶液，再分别以体积比1:10～1:30的比例缓慢加入10-25mol/L的乙醇溶液，室温搅拌反应10-30分钟，将抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab的反应混合物和CPPs-EGFP的反应混合物分别加入超滤离心管，分别以pH4.5、0.01mol/L的醋酸盐缓冲液和pH7.5、0.01mol/L的PBS为洗涤液在4℃条件下离心洗涤；将BSA-NS蛋白微球反应混合物加入超滤离心管，并以pH7.5、0.01mol/L的PBS在4℃条件下离心洗涤，以去除剩余SPDP，分别得到抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab-PDP、CPPs-EGFP-PDP、BSA-NS-PDP的SPDP衍生物，4℃保存备用；在得到的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab-PDP醋酸盐溶液中加入适量DTT使反应体系中DTT终浓度为50mmol/L，室温下轻搅30分钟，加入超滤离心管中，以pH7.5、0.01mol/L的PBS为洗涤液在4℃条件下离心洗涤，去除剩余DTT，得到抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab-PDP-SH溶液，并立即与CPPs-EG-FP-PDP、BSA-NS-PDP溶液混合，4℃搅拌15-20h，用PBS离心洗涤，沉淀，最终得到CPPs-EG-FP-BSA-NS-抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab蛋白偶联物。

5.根据权利要求1所述的抗人乳头瘤病毒小分子抗体，其特征在于，步骤C中采用纯水提取法、氯仿萃取法、冷乙醇沉淀法或硫酸铵沉淀法制备抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物。