[发明专利]肿瘤浸润淋巴细胞TIL的体外扩增方法

权利要求书

1.一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，其特征在于：正式培养前使用含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和曼宋酮C或曼宋酮G的培养基孵育24h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤为：

步骤S1、TIL细胞分离

取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于PBS中，剔除周围的血块、脂肪及坏死组织，PBS清洗一遍，剪成1mm³大小，浸入0.1μg/mL的IV型胶原酶溶液中，37℃水浴消化2h。消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤，用PBS冲洗组织块，收集滤液。细胞滤液在常温下离心，1500r/min×5min。弃上清，加入PBS制成细胞悬液后，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经PBS清洗后，按1×10⁶/mL的浓度悬浮于含10％人AB型血清和IL-2的X-VIVO-15培养基内，接种于12孔板上，3mL/孔，置于37℃、5％CO₂培养箱内培养，每3～5d换液一次。

步骤S2、培养和扩增

当孔里的淋巴细胞生长至1×10⁷时，将其转入含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和曼宋酮C或曼宋酮G的培养瓶内孵育，孵育24h后加入IL-2，置于37℃、5％CO₂培养箱内连续培养，培养过程中每隔2～3d半量更换含同等浓度IL-2的新鲜X-VIVO-15培养基，培养22～25d后收获体外扩增的TIL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤S1中IL-2的浓度为2000IU/mL。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：抗CD3单抗浓度为20ng/mL。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：抗CD28单抗浓度为20ng/mL。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：曼宋酮C或曼宋酮G的浓度为20μg/mL。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤S2中IL-2的浓度为4000IU/mL。

8.一种用于体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的培养基，其特征在于：通过在X-VIVO-15培养基中添加20μg/mL的曼宋酮C或曼宋酮G配制而成。

9.根据权利要求8所述的培养基，其特征在于：还含有20ng/mL的抗CD3单抗。

10.根据权利要求8所述的培养基，其特征在于：还含有20ng/mL的抗CD28单抗。