[发明专利]肿瘤浸润淋巴细胞TIL的体外扩增方法

说明书

本发明公开了肿瘤浸润淋巴细胞TIL的体外扩增方法，步骤为：步骤S1、TIL细胞分离：取癌旁组织剪碎浸入胶原酶溶液消化，过滤，PBS冲洗，收集滤液，离心，弃上清，加入PBS制成细胞悬液，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心，离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经PBS清洗后，按1×10⁶/mL的浓度悬浮于含10％人AB型血清和IL‑2的培养基内培养，每3～5d换液一次；步骤S2、培养和扩增：当孔里的淋巴细胞生长至1×10⁷时，将其转入含抗CD3单抗、抗CD28单抗和药物的培养瓶内孵育，24h后加入IL‑2连续培养，每隔2～3d半量更换含同等浓度IL‑2的新鲜培养基培养22～25d。

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法。

背景技术

免疫治疗是新兴的一种肿瘤治疗方式，已经被列为继手术、放疗、化疗后的第四种治疗方式，在肿瘤的综合治疗中逐渐发挥重要作用。2010年，美国FDA批准世界上第一个细胞免疫治疗产品Provenge上市，充分显示出细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的价值。

肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)是存在于肿瘤间质内的以淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群体，大多聚集在肿瘤周围或其间质呈套状围绕癌巢。其主要成分是存在于肿瘤间质内的T淋巴细胞，小部分为MHC非限制性的NK细胞，其共同特征为表达T细胞受体(T cell receptor，TCR)。TIL来自肿瘤组织区域，可特异识别自体肿瘤，具有特异的MHC限制性溶解肿瘤活性。美国NCI的Rosenberg等首次证实，从实体瘤组织分离的TIL在体外经IL-2激活并大量扩增后，可用于晚期黑色素瘤患者的治疗，其治疗效果远远高于之前发展的LAK(lymphokine activatedkiller cells)细胞治疗技术(文献：Expansion of human tumor infiltrating lymphocytes for use in immunotherapytrials.J Immunol Methods 1987)。近年发表的多篇临床试验报道显示，TIL细胞免疫治疗可治愈20％～40％晚期黑色素瘤，充分显示出TIL作为细胞免疫治疗手段在肿瘤治疗中的潜力(文献：A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes.Science 1986)。

但是，目前体外扩增TIL的方法存在两点不足：

第一，扩增效率不高，限制了肿瘤患者TIL的大量回输使用；

第二，对肿瘤细胞的杀伤力还有待提高，回输肿瘤患者体内后对肿瘤的杀伤力不足。

发明内容

本发明旨在克服现有技术不足，提供一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，一方面提高TIL细胞的扩增效率，另一方面提高其对肿瘤细胞的杀伤力。

本发明技术方案如下：

一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，正式培养前使用含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和呋喃天竺葵酮A或呋喃天竺葵酮B的培养基孵育24h。

优选地，具体步骤为：

步骤S1、TIL细胞分离