[发明专利]大肠杆菌O157的多重PCR检测引物及检测方法

说明书

本发明涉及大肠杆菌O157的多重PCR检测引物及检测方法。多重PCR检测引物包括3对引物，分别扩增O₁₅₇的rfbE、fliC、stx1基因，序列详见序列表所示。使用上述检测引物对大肠杆菌O₁₅₇DNA进行多重PCR检测，设置阳性对照和阴性对照、空白对照，所述PCR扩增条件为94℃变性5min，然后94℃预变性30s，48‑52℃退火45s，72℃延长45s，共扩增循环30‑35个循环，最后72℃延伸5min。本发明的大肠杆菌O₁₅₇检测引物、检测方法具有特异、灵敏的优点，可以实现对大肠杆菌O₁₅₇的精准鉴定。

技术领域

本发明涉及微生物分子生物学检测技术，特别是涉及大肠杆菌O₁₅₇的多重PCR检测引物及检测方法。

背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli)是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌，直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜禽，常引起严重腹泻和败血症。

大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K)。根据O抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多个血清型，其中16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泻和成人肋膜炎。大肠杆菌的血清型众多，鉴别困难。

根据不同的生物学特性，将致病性大肠杆菌分为肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、大肠杆菌(EHEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、肠外致病性大肠杆菌等(EXEC)等。

大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)是一类对人类致病的大肠杆菌，以引起肠道出血为特点，症状包括腹痛、血性腹泻、败血症、严重胃肠炎等，严重者可并发溶血性尿毒综合症，引起急性肾衰竭、溶血性贫血和血小板减少甚至死亡。大肠杆菌也被称为产志贺毒素大肠杆菌或产志贺样毒素大肠杆菌。潜伏期为1-10日，通常为48-72小时。EHEC是重要的人畜共患性和食源性致病菌。EHEC感染或人食用了被污染的食品而发病，被WHO列为四大食源性致病菌之一，公共卫生和食品安全意义重大。美国CDC调查表明，每年约有70000人感染大肠杆菌病例。EHEC主要寄生在牛、羊等家畜和其它反刍动物体内。人主要通过食用被人畜粪便污染的食物，如烹煮不彻底的肉馅制品或未经消毒的牛奶、受粪便污染的水和蔬菜等被感染。

EHEC是大肠杆菌的一个亚型，以O抗原分型，EHEC可分为O₁₅₇、O₂₆、O₁₁₁、O₁₀₄等血清型。O₁₅₇：H₇主要见于婴幼儿，以爆发流行性为主，美国在1982、1984、1993年曾三次发生O₁₅₇:H₇的爆发性流行。日本曾在1996年爆发过波及9000多人的大流行。2011年爆发于德国席卷欧洲的大肠杆菌O₁₀₄:H₄疫情导致约3000人发病，数十人死亡。

大肠杆菌的毒力因子有菌毛(黏附素)、内毒素、荚膜、外毒素等，外毒素有志贺毒素、肠毒素(包括耐热毒素LT和不耐热毒素LT)等。O₁₅₇的主要毒力因子有黏附因子(菌毛、外膜蛋白、紧密素等)、肠毒素(志贺毒素STX、溶血素、Ⅲ型分泌系统)等。