[发明专利]一种用于检测丙二酰辅酶A的分子探针

说明书

本发明公开了一种用于检测丙二酰辅酶A的分子探针。本发明所提供的用于检测丙二酰辅酶A的分子探针为自N端到C端依次包含NanoLuc荧光素酶大亚基、FapR△43蛋白和NanoLuc荧光素酶小亚基的融合蛋白。本发明的分子探针既可对体外样本提取物中丙二酰辅酶A进行检测，又可对活细胞内丙二酰辅酶A进行检测和动态观察。更重要的可以实现对活细胞不同细胞器部位丙二酰辅酶A的检测，且操作简单，因此该融合蛋白有潜力做成商业化产品。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测丙二酰辅酶A的分子探针。

背景技术

丙二酰辅酶A(Malonyl-CoA)是脂肪酸合成代谢过程中重要的中间代谢产物，也是脂肪酸氧化分解过程中的调节分子。细胞中malonyl-CoA的增加促使其与线粒体表面脂肪酸转运相关蛋白CPT1结合抑制脂肪酸向线粒体的转运，从而减少脂肪酸的氧化分解。最近的研究发现malonyl-CoA还是蛋白质翻译后修饰丙二酰化(malonylation)反应过程中的基团供体。在一定条件下malonyl-CoA可自发的使蛋白质发生malonylation修饰。Malonylation修饰的功能目前尚在研究中。

目前，Malonyl-CoA的检测方法主要有三类。

第一类，基于脂肪酸合成反应中代谢物的转换的方法间接检测Malonyl-CoA的量[Guynn,R.W.,D.Veloso,and R.L.Veech,The concentration of malonyl-coenzyme Aand the control of fatty acid synthesis in vivo.J Biol Chem,1972.247(22):p.7325-31.McGarry,J.D.,M.J.Stark,and D.W.Foster,Hepatic malonyl-CoA levels offed,fasted and diabetic rats as measured using a simple radioisotopic assay.JBiol Chem,1978.253(22):p.8291-3.]。用纯化的乙酰辅酶A羧化酶(ACC1)和脂肪酸合酶(FASN)体外构建脂肪酸合成的反应体系。将待测样本，一般为组织和细胞的提取液加入此体系中。通过光谱观察NADPH的减少，或者观察同位素标记的(C14)Acetyl-CoA转化为脂肪酸的多少来推算样本中Malonyl-CoA的量。

第二类，利用液相或气相色谱直接检测Malonyl-CoA的量[Hosokawa,Y.,et al.,Determination of short-chain acyl-coenzyme A esters by high-performanceliquid chromatography.Anal Biochem,1986.153(1):p.45-9.King,M.T.,P.D.Reiss,andN.W.Cornell,Determination of short-chain coenzyme A compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography.Methods Enzymol,1988.166:p.70-9.Reszko,A.E.,et al.,Assay of the concentration and 13C-isotopic enrichmentof malonyl-coenzyme A by gas chromatography-mass spectrometry.Anal Biochem,2001.298(1):p.69-75.]。首先利用强酸从组织或细胞中粗提取Malonyl-CoA，将提取物利用High Performance Liquid Chromatography(HPLC)高效液相色谱直接检测，根据标准品的量，利用色谱峰的高度计算出样本中Malonyl-CoA的量。另外还可以将提取物中的Malonyl-CoA通过化学方法转变成丙二酸及其衍生物，再利用Gas Chromatography-MassSpectrometry(GC-MS)气相色谱联合质谱实现检测。