[发明专利]一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备及其应用方法在审
| 申请号： | 201810643431.8 | 申请日： | 2018-06-21 |
| 公开（公告）号： | CN108754027A | 公开（公告）日： | 2018-11-06 |
| 发明（设计）人： | 李文刚;刘胜利;刘玲玲;吕玉金;吴凤笋;张永涛 | 申请（专利权）人： | 河南牧业经济学院 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6837 |
| 代理公司： | 北京轻创知识产权代理有限公司 11212 | 代理人： | 谈杰 |
| 地址： | 450046 河南*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 制备 繁殖障碍 性病 基因芯片 检测 探针 芯片 基因芯片杂交 多重PCR反应 激光共聚焦 生物学软件 特异性引物 保守序列 待测样品 有效解决 点样仪 基因组 醛基化 扫描仪 一次性 点式 点样 筛查 上喷 洗涤 样本 应用 费力 溶解 扫描 合成 杂交 病毒 | ||
1.一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)设计引物和探针：以CSFV、PPV、PRRSV、JEV及PCV2的保守基因设计特异性引物与探针序列如下：
CSFV的引物及探针序列为：
F:5’-TGCAACTGAATGACGGGAC-3’
R:5’-Cy3-GCCAAATACCTCCTACTGACCAC-3’
P:NH2-TTTTTTTTTTCGTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCAGC
PPV的引物及探针序列为：
F:5’-AAAAACAATCCACCAGGACAAC-3’
R:5’-Cy3-CTGGATCTCATTTTTGCTGTGA-3’
P:NH2-TTTTTTTTTTGATTTCAATGACTCTCCTCAACAACC
PRRSV的引物及探针序列为：
F:5’-CGGGCGGTATGTCCTAAGTA-3’
R:5’-Cy3-ACCTCAACTTTGCCCCTTTT-3’
P:NH2-TTTTTTTTTTTGCGTTGACTTGCTTCGTCATTAGGTC
JEV的引物及探针序列为：
F:5’-AGCTTGTTGGACGGCAGAG-3’
R:5’-Cy3-GCCACATGATTGAGCCTTCA-3’
P:NH2-TTTTTTTTTTCCGATGGAAAGCAGGAAAGCAGTGGAAAAGAGTGT
PCV2的引物及探针序列为：
F:5’-CTATCAAGCGAACCACAGT-3’
R:5’-Cy3-GGTCTACATTTCCAGCAGT-3’
P:NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTCACAGCCCTCACCTATAGCCCCTATTG，
在每段探针下游5’端都进行Cy3荧光标记，探针的5’端氨基化修饰，并在氨基和探针之间加上10-15个T；
2)按常规方法对引物和探针进行合成；
3)基因芯片的制备：用TE Buffer溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪按预先设定好的程序在醛基化基片上接触式点样，点样完毕后将芯片静置于80℃烘箱固定干燥2小时。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备方法，其特征在于，所述引物的浓度为10μM。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备方法，其特征在于，所述探针的浓度为1μM-5μM。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备方法，其特征在于，每样点的点样量约为60nL，样点直径约为1mm，点心间距为2mm，点样时环境相对湿度55％-65％，温度15℃-30℃，点样阵列根据实验要求设定。
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