[发明专利]一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：腐生葡萄球菌间接血凝抗原，4℃保存；标准阳性血清，-20℃冻存；标准阴性血清，-20℃冻存；稀释液，4℃保存；所述腐生葡萄球菌间接血凝抗原是将腐生葡萄球菌菌株CCTCC M 2018117株进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到。

2.根据权利要求1所述的所述的一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，腐生葡萄球菌间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制阿氏液：柠檬酸钠0.8克，柠檬酸0.055克，葡萄糖2.05克，氯化钠0.42克，双蒸水100ml；混匀后113℃高压10min，冷却至室温后4℃保存；

(2)配制磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2)：称取206.21克Na₂HPO₄·12H₂O，30.46克KH₂PO₄，68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，混匀后121℃高压20min，冷却至室温保存；

(3)静脉采集绵羊红细胞100ml，与100ml灭菌阿氏液混匀，在4℃静置5天，使红细胞充分沉淀；将沉淀好的红细胞摇匀，用灭菌纱布过滤，滤出液收集至大离心管中，以4000r/min离心15min，弃去上清；用磷酸盐缓冲液洗涤红细胞4遍；

(4)用磷酸盐缓冲液将红细胞悬浮至5％(v/v)的浓度，与2.5％的戊二醛按照5:1(v/v)的比例慢慢混匀，置磁力搅拌器上搅拌4h，然后用磷酸盐缓冲液洗涤5遍；

(5)用磷酸盐缓冲液将上述红细胞悬浮至5％(v/v)的浓度，再与等量1/20000(w/v)的鞣酸溶液混匀，即鞣酸溶液的终浓度为1/40000(w/v)，所用的溶液均为磷酸盐缓冲液；将上述红细胞悬液置于37℃水浴中，静置30min；然后用磷酸盐缓冲液洗涤4遍，最后用磷酸盐缓冲液重悬至5％(v/v)的浓度；

(6)将腐生葡萄球菌MC2016的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原；

(7)以步骤(6)得到的三种用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤(5)得到的绵羊红细胞悬液，得到腐生葡萄球菌间接血凝抗原，抗原致敏红细胞的终浓度为150μg/ml～200μg/ml。

3.根据权利要求1所述的所述的一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标准阳性血清的制备方法为：取-80℃冻存的腐生葡萄球菌甘油菌MC2016，用接种环蘸取菌液，划线接种于胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板上，置于37℃、5％CO₂箱中培养15～20小时，再挑取单克隆菌株接种于10ml胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃，200r/min培养15～18小时，然后把10ml菌液转接到200ml胰蛋白胨大豆肉汤中，继续在37℃摇床中200r/min培养12～15小时，培养完毕后，将全部菌液以6000r/min离心15min，用磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，最后用10ml缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，得到超声破碎用腐生葡萄球菌菌液；再将其置于碎冰中，在超声破碎仪中，以超声5s，间隔1s的程序，超声破碎30min，然后冻融1次，再超声破碎1次；将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，用紫外分光光度计测定上清中的蛋白浓度；

将上述制备的腐生葡萄球菌抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈部皮下免疫5只体重2.5公斤左右的健康兔，接种抗原量200μg/只，2周后用同等剂量的抗原(与等体积弗氏不完全佐剂混合)加强免疫1次，间隔2周后再加强免疫1次；第3次免疫后2周，采血分离血清，用琼脂扩散试验检测血清抗体效价，效价达1:32及以上为合格阳性血清；若达不到标准，可继续加强免疫，直至血清效价符合标准。

4.根据权利要求1所述的所述的一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标准阴性血清的制备方法为：选取体重2.5公斤左右、未感染腐生葡萄球菌的健康樱桃谷鸭，颈动脉放血直至死亡，将血液收集至大离心管中，旋紧盖子，室温过夜，然后3000r/min离心15min，收集血清，经琼脂扩散试验检测，结果为阴性，即为标准阴性血清。