[发明专利]一种制备刺葡萄两个主要花色苷标准品的方法

说明书

本发明公开了一种利用高速逆流色谱分离制备刺葡萄浊汁中两种主要花色苷标准品的方法。该方法采用大孔吸附树脂对刺葡萄浊汁进行富集，经乙醇的洗脱，冷冻干燥处理，获得粗样，粗样经溶剂体系水进行高速逆流分离，分离制备的花色苷标准品分别是锦葵素‑[3‑O‑葡萄糖‑]‑[5‑O‑葡萄糖]，纯度为95.8%和锦葵素‑[3‑O‑β‑葡萄糖基‑6‑香豆酰]‑[5‑O‑β‑D‑葡萄糖]，纯度为92.2%。从刺葡萄浊汁中制备这两个花色苷产率分别为122.77mg/L和78.09mg/L。本发明建立了高速逆流色谱分离刺葡萄浊汁的花色苷及多酚的方法，制备的高纯度标准品的方法可以满足对刺葡萄的天然花色苷的大规模制备。

技术领域

本发明涉及花色苷标准品的制备方法，具体涉及从刺葡萄汁中制备两个主要花色苷标准品的方法。

背景技术

刺葡萄(Vitis davidii Foex)属葡萄属东亚种群，在陕西、甘肃、华中、华南及西南等地都有广泛的种植面积。其中，湖南是刺葡萄集中分布的省份之一，已有两百多年的栽培历史，以湘西和湘南为多【石雪晖，王益志，陈祖玉等.湖南刺葡萄植物学性状及抗病性研究初报[J].中外葡萄与葡萄酒，2002(02)：22-24】。多项研究表明刺葡萄产量高，抗性强，果实风味好，果汁多，糖酸比高，含单宁少，含有黄酮类化合物主要是原花青素、白黎芦醇等，刺葡萄所含的天然生物活性物质有很大的开发空间，有更大的应用前景。

花色苷是一类羟基和甲基化的2-苯基-苯并吡喃阳离子(即花色素)与一个或多个糖分子通过糖苷键结合而成的化合物。花色苷广泛存在于植物的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中，由于其独特的功能性，它被应用于清除体内自由基、增殖叶黄素、抗肿瘤、抗癌、抗炎、抑制脂质过氧化和血小板凝集、预防糖尿病、减肥、保护视力等方面。花色苷作为一种天然色素，安全、无毒，且对人体具有许多保健功能，已被应用于食品、保健品、化妆品、医药等行业。但通常花色苷结构并不稳定，很多因素可以加速花色苷的降解，促使色素褪色，如pH值、温度、光、氧气等对其稳定性影响很大【孙建霞，张燕，胡小松，等.花色苷的结构稳定性与降解机制研究进展[D],2009.】。这使得纯的花色苷标准品的制备与保存都非常困难，所以通常花色苷标准品都比较昂贵，从而给花色苷的利用和开发，以及相关研究带了很大阻碍。

刺葡萄中富含花色苷类色素，其含量是欧美等国外葡萄品种的多倍。刺葡萄中花色苷色价高，性能较稳定，对光和酸性物质等有较好的耐性，即使常温条件下也有较好的稳定性【潘小红，谭兴和，邓洁红.刺葡萄花色苷色素稳定性研究[J].食品科技，2006(12)：110-112.】。鉴于其稳定的性质，其在食品及化妆品中可以进行加工利用，并且可以作为一种天然色素使用【谢聃,马玉美,王辉宪,等.刺葡萄皮色素的提取及性能测定[J].酿酒科技,2007(01)：23-27.】。目前，刺葡萄果皮中的色素提取取得了一定进展，邓洁红等利用正交旋转组合设计试验，发现刺葡萄皮色素的提取量受到时间、温度和料液比的影响【邓洁红,谭兴和,郭时印,王等.响应面法优化刺葡萄皮色素提取工艺参数[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2007(06)：694-699.】。

在葡萄果实，葡萄酒或葡萄汁中检测花色苷常用的方法为高效液相色谱，而该检测方法无论是定性还是定量检测中都需要标准品(花色苷单体)用于对照。花色苷单体分离精制的操作过程十分复杂而且成本相对较高，大部分已报道的研究多采用色素混合粗提物作为研究对象，花色苷的降解规律没有统一的说法和系统的论述。所以，采用简单易行的方法得到大量花色苷单体将对下一步的研究有着重大意义。目前基于现有文献和专利材料，还未明确刺葡萄主要花色苷标准品的制备方法。花色苷的标准品在各大试剂公司公布的价格均较高，且还有很多花色苷类型还没有标准品，这使得花色苷的检测成本较高。