[发明专利]一种基因工程菌及其在制备L-草铵膦中的应用

说明书

本发明公开了一种基因工程菌及其在制备L‑草铵膦中的应用。该基因工程菌包括大肠杆菌和转入大肠杆菌的重组质粒，所述重组质粒包含转氨酶基因和磷酸吡哆醛合成途径酶基因；所述转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述磷酸吡哆醛合成途径酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～5所示。本发明利用基因工程技术，通过在大肠杆菌中表达核糖‑5‑磷酸途径合成的关键基因PdxST，或增强大肠杆菌自身PLP合成途径关键基因epd，pdxJ和dxs的表达，构建得到辅酶强化的转氨酶基因工程菌，不仅显著提高了胞内辅酶PLP的含量，使该基因工程菌在生产L‑草铵膦时无需添加外源PLP，而且还显著提高了转氨酶的酶活和稳定性，延长了转氨酶的半衰期，降低了生产成本，提高了L‑草铵膦的生产效率。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种基因工程菌及其在制备L-草铵膦中的应用。

背景技术

转氨酶(EC 2.6.1.X)是一类催化氨基转移作用的酶，能够催化氨基供体(氨基酸或胺)上的氨基转移到前手性的受体酮或酮酸上，得到手性胺或手性氨基酸，以及副产物酮或酮酸(图1)，因其具有高选择性、高转化率和温和的反应条件赢得了广大研究者的青睐。

使用转氨酶催化合成R-西他列汀(Savile CK,Janey JM,Mundorff EC,Moore JC,Tam S,Jarvis WR,Colbeck JC,Krebber A,Fleitz FJ,Brands J,Devine PN,Huisman GW,Hughes GJ.Biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines from ketonesapplied to sitagliptin manufacture.Science 2010；329:305-309.)已经实现工业生产。使用转氨酶能够催化合成多种手性胺如S-利斯的明(Fuchs M,Koszelewski D,TauberK,Kroutil W,Faber K.Chemoenzymatic asymmetric total synthesis of(S)-Rivastigmine usingω-transaminases.Chemical communications 2010；46:5500.)，R-或S-美西律(Koszelewski,Dominik,Pressnitz,Desiree,Clay,Dorina,Kroutil,Wolfgang.Deracemization of MexiletineBiocatalyzed byω-Transaminases,OrganicLetters,2009；11:4810-4812)和手性氨基酸如L-草铵膦(K Bartsch,R Dichmann,PSchmitt,E Uhlmann and A Schulz,Stereospecific Production oftheHerbicidePhosphinothricin(glufosinate)by Transamination:Isolation andCharacterization of a Phosphinothricin-specific Transaminasefrom Escherichiacoli[J].Applied and Environmental Microbiology,1990,56:1-6.，)L-高苯丙氨酸(Hsueh-Hsia Lo,Shih-KuangHsu,Wei-De Lin,Nei-Li Chan,Wen-Hwei Hsu,AsymmetricalSynthesis of l-Homophenylalanine Using Engineered Escherichia coli AspartateAminotransferase[J].Biotechnology progress,2005,21:411-415)等关键药物手性中间体或手性化学品。

目前，已知的转氨酶都需要磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶，PLP是最通用的辅酶之一，以PLP为辅酶的酶包括转氨酶，脱羧酶，裂解酶，醛缩酶，消旋酶等，在生物体中起到关键作用，参与包括脱羧、转氨、消旋、断裂Cα-Cβ键和α,β-消除反应等超过160种酶促反应，占目前已知细胞中全部反应的4％。