[发明专利]一种无血清培养基及其制备与细胞培养方法

说明书

本发明公开了一种无血清培养基，其包括IMDM培养基、血小板裂解液和肝素钠。培养基以血小板裂解液代替血清制备无血清培养基，其中，血小板裂解液可来自自体或同种异体全血，通过反复冻融裂解和离心获得的血小板裂解液富含多种促进间充质干细胞增殖分化的细胞因子和免疫相关因子，且由于血小板裂解液来源于人体，不含异种蛋白，极大降低了免疫排斥反应，具有更高的生物安全性。利用该无血清培养基对期待间充质干细胞进行体外连续传代培养，细胞形态、增殖能力与传统有血清培养基培养的细胞几乎一致。还公开了该培养基的制备方法及利用该培养基培养细胞的方法，工艺步骤简单，条件温和，适宜于工业化批量制备。

技术领域

本发明属于干细胞分化技术领域，涉及一种无血清培养基的制备工艺，具体地说涉及一种以血小板裂解液代替血清制备无血清培养基的方法及利用该培养基培养细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞是一种来源于中胚层的多能干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，其广泛存在于各种机体组织中，易于分离、培养、扩增和纯化，免疫原性低，不存在伦理问题的争议，在组织工程、基因治疗和免疫治疗方面有着巨大应用前景。研究表明，间充质干细胞不仅可以分化为多种间质组织的细胞，如骨、脂肪、肌肉、韧带等，在一定诱导条件下还可横向分化为外胚层和内胚层细胞，如上皮细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞、表皮干细胞等。

虽然脐带来源间充质干细胞的原始丰度高于骨髓、骨膜、胎盘来源间充质干细胞，但其数量依然需要经过体外数代扩增才能达到临床应用的需求。然而，脐带间充质干细胞并非永生化的干细胞，在多次传代后，会随扩增的数量增多而逐渐分化，最终丧失干细胞特性，进而失去了治疗功能，因此选择能最大限度维持干细胞特性及高扩增效率的培养体系至关重要。

传统的培养基体系一般含血清和动物源性成分，存在异源污染和免疫排斥的风险，给科研与临床应用带来了诸多不利因素，因此开发一种无异源培养基，选择合适的血清替代物和培养基，使异源性成分达到含量最低或无异源性物质成为了当前亟待解决的技术问题。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于传统含血清培养基存在异源污染和免疫排斥的问题，从而提出一种无异源污染或免疫排斥问题的无血清培养基及其制备与细胞培养方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

本发明提供一种无血清培养基，所述培养基包括IMDM培养基、血小板裂解液和肝素钠。

作为优选，所述血小板裂解液的体积浓度为5％，所述肝素钠的含量为10U/ml。

本发明还提供一种制备所述无血清培养基的方法，其包括如下步骤：

S1、获取血小板，通过冻融裂解处理使血小板裂解并释放生长因子；

S2、将经步骤S1处理得到的冻融血小板离心处理，取上清液；

S3、将所述上清液过滤处理，得到血小板裂解液。

S4、按比例将步骤S3得到的血小板裂解液与肝素钠添加到IMDM培养基中，得到无血清培养基。

作为优选，所述步骤S1包括如下步骤：

S11、获取浓度为1.0*10¹²/L的血小板；

S12、将所述血小板在-80℃下冷冻过夜；

S13、将步骤S12处理后的血小板置于37℃下溶融，使血小板裂解并释放生长因子；

S14、重复上述步骤S12、S13冷冻溶融的操作5次，得到冻融血小板。

作为优选，所述步骤S2为将所述冻融血小板在4℃下以3500r/min的离心速度离心处理30min。