[发明专利]一种元麦提取物的制备方法及其在细胞抗氧化方面的用途

权利要求书

1.一种元麦提取物的制备方法及其在抗氧化方面的用途，其特征在于，以新鲜元麦为原料，从中提取、制备高活性物质，通过H₂O₂诱导建立细胞氧化损伤模型，采用MTT的方法测定元麦提取物对细胞活力的保护作用；采用试剂盒检测的方法研究细胞ROS水平、细胞抗氧化酶酶活(如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、细胞中关键抗氧化剂含量(如还原型谷胱甘肽(GSH))、以及表征细胞膜完整性重要酶酶活(如乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase，LDH))的变化情况，发现了元麦提取物在细胞抗氧化方面的显著效果。具体方法如下：

(1)元麦的预处理：称取颗粒饱满、洗净晾干的元麦仁，粉碎后过40-80目筛，得到元麦粉末；

(2)提取液的制备：称取元麦粉末，按照1∶10-1∶20料液比(以元麦粉末质量倍数计)加入浓度为40-80％乙醇-水溶液(以乙醇-水溶液体积百分比计)，充分搅拌混匀，在30-50℃水浴条件下超声处理2-8h，再以3000-8000rpm/min条件离心5-10min，重复提取2-5次，收集上清为元麦提取液；

(3)提取液的浓缩：将提取液装入体积合适的圆底烧瓶中，置于旋转蒸发仪，以80-150rpm/min为转速，恒温25-50℃为水浴条件进行蒸干，加入1-5mL纯水，反复摇晃震荡烧瓶，使瓶底的残余物溶解，收集溶解后的液体为浓缩液；

(4)提取液的萃取：在浓缩液中加入少量饱和食盐水，再按1∶1比例(以浓缩液体积倍数计)加入乙酸乙酯进行萃取，震荡摇匀、静止5-15min，待完全分层，重复萃取3-5次，收集上层萃取液；

(5)提取物的制备：将萃取液置于旋转蒸发仪，以80-150rpm/min为转速，恒温25-50℃为水浴条件进行蒸干，加入1-5mL纯水，反复摇晃震荡烧瓶，使瓶底的残余物溶解，收集液体于零下20-80℃预冷24-60h，再以零下40-65℃条件真空冷冻干燥18-60h，得到元麦提取物；

(6)细胞的培养：取出保存于-80℃液氮中的细胞冻存管，在37℃温水中轻轻摇动，将融化后的细胞冻存液移至离心管中，加入2-5mL含有100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、1％1mol/L Heps缓冲液的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose(DMEM)培养基(分别以DMEM培养基体积浓度、体积浓度、体积百分比计，以Heps缓冲液体积浓度计)，1000rpm/min条件下离心3-7min，舍弃上清液，之后加入5-30mL含有20％胎牛血清的上述培养基(以加入血清后培养基体积百分比计)，吹打均匀，转移细胞悬液至底面积为25-75cm²的细胞培养瓶中，放入37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温培养箱(以培养箱体积浓度计)进行培养；

(7)细胞的传代：在步骤(6)培养瓶中加入2-10mL胰蛋白酶，轻轻摇晃后放入步骤(6)恒温箱，消化贴壁细胞1-5min，期间取出培养瓶，在物镜为10倍的显微镜下观察，直至细胞基本由贴壁条状或片状变为游离状即可，加入5-15mL步骤(6)不含血清培养基终止反应，3000rpm/min离心5min后，在沉淀中加入5-30mL步骤(6)含血清培养基，吹打成细胞悬液，转移至新培养瓶，待细胞长满至瓶底面积70-90％时进行下一次传代；

(8)细胞氧化损伤模型的建立：选取步骤(7)培养至3-6代的细胞进行建模，向消化后的细胞沉淀中加入适量培养基，吹打成单细胞悬液，浓度为1×10⁵-1×10⁶个/mL(以单细胞悬液体积浓度计)，在96孔板中每孔接种100μL细胞悬液，最外圈用100μL无菌蒸馏水替代加入，置于37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温培养箱(以培养箱体积百分比计)培养24-48h，之后待细胞长满至96孔板底部，加入终浓度为400-2400μmol/L的H₂O₂-水溶液(以H₂O₂-水溶液体积浓度计)，培养2-48h；

(9)元麦提取物的保护作用：选取步骤(7)培养至3-6代的细胞，制成1×10⁵-1×10⁶个/mL单细胞悬液(以单细胞悬液体积浓度计)，在96孔板中每孔接种100μL细胞悬液，最外圈用100μL无菌蒸馏水替代加入，置于37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温培养箱(以培养箱体积百分比计)培养24-48h，待细胞长满至96孔板底部，取出，加入终浓度为1-20μg/mL的元麦提取物(以提取物溶液的体积浓度计)，培养时间6-48h；

(10)具有抗氧化活性食品的制备：将本发明的元麦提取物以一定比例直接加入液体饮料中，制成功能性饮料，也可以加入固体食品中，用于面包、面条、饼干、糖果、固体饮料等的制作。