[发明专利]一种快速扩增核酸的方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，涉及核酸扩增技术，具体涉及一种普适的，在现有PCR体系、现有PCR扩增仪基础上，仅需简单改变PCR程序，使PCR反应液仅在两个温度点之间反复升温和降温，不在任何温度做时间停留，或者停留时间极短(0‑2s)，在变温的过程中即可实现对目标序列快速扩增的核酸扩增方法。该方法打破常规、理论新颖，操作简单、易行，依靠现有条件和平台即可大幅度节约核酸扩增的时间，提高单位时间生产力。该方法可适用于各种基于PCR技术的核酸扩增体系，对于临床疾病的检测和分析、环境监测、食品药品的物种鉴定等都有很高的实用价值。

技术领域

本发明属于核酸扩增技术，具体地说是通过将聚合酶链式反应(PCR)的反应液在两个温度点之间进行反复升温和降温，在变温的过程中实现对目标序列的快速扩增的一种方法。

背景技术

聚合酶链式反应法(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种分子生物学常用技术，由于其可以特异性地扩增极其微量的DNA，目前已经广泛应用于临床病原微生物以及疾病的诊断、法医学鉴定、环境监督、食品药品真伪鉴定等。常规PCR技术依靠热循环仪的升降温，使模板DNA序列经过高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤，完成对目标序列的一次扩增，通过20-40次的反复扩增，可以实现对微量DNA的指数型扩增。分子生物学经典工具书《分子克隆实验指南》一书中指出一个典型的PCR程序通常为94℃30s、55℃30s、72℃1min，循环30次，加上升降温过程中的时间，一个典型的PCR过程需要1个小时以上。但是，随着PCR技术应用领域的不断延展，需要PCR分析的样本类型及样本量日益增多，这就对样本的分析效率和成本提出了更高的要求。因此，进一步缩短PCR扩增时间，发展快速PCR技术，对于大样本量的快速基因检测以及即时检验(point-of-care testing)的发展都具有十分重要的意义。

目前，关于快速PCR的研究主要集中在热循环仪的改造上，以大幅提高升降温速率来实现快速的核酸扩增，通常采用的手段包括：①改变加热方式，如采用光加热、空气加热等；②采用传热更快的反应容器；③缩小反应体积等。然而，由于升降温速率大幅度提高，使得聚合酶延伸的时间缩短，并不能保证PCR具有最佳的扩增效率，从而导致了一些长片段序列的扩增失败，限制了快速PCR技术的使用。同时由于已报道的快速PCR技术均需要使用新型的PCR扩增装置以及新型的样品反应装置，实施该技术的经济成本和时间成本都较高，所以现有的快速PCR技术实质上还没有得到广泛的应用，也没有惠及到相应的行业和从业人员。

发明内容

本发明的目的是针对目前快速PCR必须使用特定仪器以及特殊快速DNA聚合酶的局限性，提供一种在不改变PCR体系的前提下，利用现有常规PCR仪器即可以实现的快速扩增核酸的方法。

本发明的技术方案如下：将聚合酶链式反应(PCR)的反应液在两个温度点之间进行升温和降温，在变温的过程中实现对目标序列的快速扩增。

本发明所涉及的两个温度点分别为高温点和低温点：高温点可以在目标扩增序列的退火温度(Tm)到98℃之间取任意值，低温点可以在引物的退火温度附近取任意值，一般为Tm±5℃。

本发明所述的快速核酸扩增方法是一种高温点和低温点不断交替往复的变温过程，且在高温点和低温点处不做时间停留，或者停留时间时间极短(0-2秒)。这一扩增模式不同于传统的PCR扩增模式：(1)三段式。设置三个温度点，使PCR反应液在每个温度点停留几十秒至几分钟不等，依次进行变性、退火、延伸三个过程，经过多个循环此种模式的扩增，实现对目标序列的快速扩增。(2)两段式。设置两个温度点，使PCR反应液在每个温度点停留几十秒至几分钟不等，依次进行变性、(退火+延伸)两个过程，经过多个循环此种模式的扩增，实现对目标序列的快速扩增。

本发明所涉及的两个温度点，在同一个反应的不同循环中，可以是不同的值，只需保证在上述高温点和低温点的可取范围内即可。

本发明所涉及的引物的退火温度可在40-80℃之间变化，最优温度在70℃附近。