[发明专利]靶向癌症的重组溶瘤基因-腺病毒及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 201810651914.2 | 申请日： | 2018-06-22 |
| 公开（公告）号： | CN110628728A | 公开（公告）日： | 2019-12-31 |
| 发明（设计）人： | 章康健;方先龙;刘新垣;顾锦法;倪爱明 | 申请（专利权）人： | 上海元宋生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N7/01 | 分类号： | C12N7/01;C12N15/861;C12N15/66;A61K35/761;A61K38/17;A61K48/00;A61P35/00 |
| 代理公司： | 31104 上海华工专利事务所(普通合伙) | 代理人： | 缪利明;赵孟琴 |
| 地址： | 201415 上海市奉贤区沪*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 腺病毒 溶瘤 基因 制备治疗癌症 病毒基因组 腺病毒载体 抗癌试验 治疗效果 表达框 癌细胞 靶向 构建 癌症 复制 病毒 驱动 应用 | ||
1.一种靶向癌症的重组溶瘤基因-腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-VGLL4，其特征在于，所述重组溶瘤基因-腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-VGLL4由survivin启动子驱动病毒E1A基因，同时病毒基因组敲除了E1B基因区域，并在该基础上携带了插入了VGLL4表达框片段。
2.一种如权利要求1所述的靶向癌症的重组溶瘤基因-腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-VGLL4的构建方法，包括以下步骤：
步骤一、质粒pCA13-VGLL4的构建
以质粒pcDNA-flag-VGLL4为模板，设计引物K-VGLL4-HIND3-F和K-k-VGLL4-R，PCR获得VGLL4基因片段，对VGLL4基因片段和pCA13质粒进行Hind III和BamH I双酶切，将VGLL4基因酶切片段与pCA13酶切片段进行连接，获得质粒pCA13-VGLL4；
步骤二、质粒pShuttle-sp-E1A-ΔE1B-VGLL4的构建
以步骤一的质粒pCA13-VGLL4为模板，设计引物一步克隆引物-F和一步克隆R3，进行PCR扩增，获得VGLL4表达框片段；接着，使用BglII单酶切质粒pShuttle-sp-E1A-ΔE1B，然后将线性化的pShuttle-sp-E1A-ΔE1B和VGLL4表达框片段采用一步克隆法，构建获得质粒pShuttle-sp-E1A-ΔE1B-VGLL4；
步骤三、pXYA16质粒的BJ5183感受态的制备
用HindIII酶切pBHGE3质粒，使用SpeI酶切pAdEasy-1质粒，然后将上述两种酶切后的质粒共转至大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，获得携带E3区的重组大质粒；接着，将该重组大质粒转入大肠杆菌DH5α中扩增，获得质粒pXYA16；接着，将所述pXYA16质粒转入大肠杆菌BJ5183感受态中，得到携带pXYA16质粒的大肠杆菌BJ5183，再将该大肠杆菌制备成感受态；
步骤四、同源重组构建pAd-sp-E1A-ΔE1B-VGLL4
PmeI酶切步骤二鉴定成功的pShuttle-sp-E1A-ΔE1B-VGLL4，接着进行FastAp去磷酸化，获得去磷酸化线性化的pShuttle-sp-E1A-ΔE1B-VGLL4，然后转化入步骤三的携带pXYA16质粒的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中，获得pAd-sp-E1A-ΔE1B-VGLL4；
步骤五、重组溶瘤基因-腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-VGLL4的包装
PacI酶切线性化步骤四的质粒pAd-sp-E1A-ΔE1B-VGLL4，使用EffecteneTransfection Reagent转染试剂将该线性片段转染入HEK-293细胞中，产生重组溶瘤基因-腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-VGLL4。
3.一种如权利要求1所述的重组溶瘤基因-腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-VGLL4在制备治疗癌症的药物中的应用。
4.一种治疗癌症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1所述的重组溶瘤基因-腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-VGLL4。
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