[发明专利]一种动态记录苹果花粉管微丝形态的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种动态记录苹果花粉管微丝形态的试剂盒，其特征在于：包括以下试剂组合：

用于配制金粉悬液的试剂：粒径为0.06～0.08μm的金粉、质量百分含量为65％～70％的乙醇和质量百分含量为40％～50％的甘油；

用于制备DNA子弹的试剂：1.5～2.0mol/L CaCl₂、0.05～0.10mol/L亚精胺、质量百分含量为65％的乙醇和无水乙醇；

花粉液体培养基：由0.06～0.08g/ml葡萄糖、0.20～0.25mg/ml CaCl₂和0.06～0.08mg/ml硼酸组成。

2.如权利要求1所述的动态记录苹果花粉管微丝形态的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下试剂组合：

用于配制金粉悬液的试剂：粒径为0.08μm的金粉、质量百分含量为70％的乙醇和质量百分含量为50％的甘油；

用于制备DNA子弹的试剂：2.0mol/L CaCl₂、0.10mol/L亚精胺、质量百分含量为65％的乙醇和无水乙醇；

花粉液体培养基：由0.06～0.08g/ml葡萄糖、0.20～0.25mg/ml CaCl₂和0.06～0.08mg/ml硼酸组成。

3.应用权利要求1-2任一权利要求所述的试剂盒动态记录苹果花粉管微丝形态的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)配制金粉悬液；

2)制备DNA子弹；

3)用培养皿体外培养花粉，收集完成水合的花粉；

4)将水合完毕的花粉平铺于用花粉液体培养基湿润的NC尼龙膜上；

5)装配可裂膜，打开基因枪装置，将氦气压力大小调至高于可裂膜压力，进行基因枪轰击；

6)取出轰击后的花粉，用花粉液体培养基将花粉洗脱，洗脱至盛有固体培养基的平皿中，在超净台吹干至粘稠状态；

7)将含有洗脱后的花粉的固体培养基置于潮湿的直径为15cm大号的玻璃皿中，暗培养一段时间；

8)将培养充分的花粉管置于全内反射荧光显微镜下观察，根据基因所连接荧光蛋白的不同选择不同的激发光进行观察，动态记录苹果花粉管微丝的形态。

4.如权利要求3所述的动态记录苹果花粉管微丝形态的方法，其特征在于：步骤1)中，所述金粉用量为60mg，加入1.0ml 65％乙醇，震荡20min；1000rpm离心10s，弃上清；加入1.0ml无菌水，继续震荡5min；1000rpm离心10s，弃上清；用1.0ml 40％甘油将金粉重悬，震荡8min，得到终浓度为50mg/ml的金粉悬液，于4℃保存。

5.如权利要求4所述的动态记录苹果花粉管微丝形态的方法，其特征在于：步骤2)中，用分光光度计测定携带有外源目的基因的质粒的浓度，所述浓度为800ng/μl；取5μl步骤1)的金粉悬液，加入6μl质粒；加入8倍质粒体积的2.0mol/L CaCl₂后加入45μl的0.10mol/L亚精胺；震荡仪上震荡8min；10000rpm离心15s，弃去上清；

加入250μl 65％乙醇，10000rpm离心15s，弃去上清；此操作步骤重复2次；

加入8μl无水乙醇，进行重悬。

6.如权利要求5所述的动态记录苹果花粉管微丝形态的方法，其特征在于：步骤3)中采用直径为2cm的培养皿，向0.8g花粉中加入1.5ml花粉液体培养基培养花粉35min，直至花粉管长度为4μm。

7.如权利要求6所述的动态记录苹果花粉管微丝形态的方法，其特征在于：步骤4)中用枪头吸取花粉液体培养基底部水合完毕的花粉，平铺于用花粉液体培养基湿润的NC尼龙膜上，此操作在直径为10cm的玻璃培养皿中进行，且培养皿中放置大小合适的浸湿的滤纸；在超净台中通风吹至NC尼龙膜上的花粉呈潮湿状态，此时大量花粉液体培养基被吹干。