[发明专利]多倍体罗汉果植株的培育方法

说明书

本发明公开了多倍体罗汉果植株的培育方法，包括诱导培养、转接培养、生根培养、纯化培养、扩大培养，选取取罗汉果雌株无菌试管苗茎尖，接种于含有甘露醇的诱导培养基中培养得丛芽，其中甘露醇中含有L‑甘露醇；将丛芽在转接液体培养基中培养得到幼芽；将幼芽放入生根培养基中培养获得完整的带根苗，进行染色体倍性鉴定，将鉴定合格的苗切成带腋芽的茎段；将茎段接种于纯化培养基中纯化2‑3代，得到多倍体苗；将多倍体苗培养扩大液体培养基中扩繁培养得多倍体罗汉果雌株。有益效果为：本发明配乐方法能够快速、高效获得具有优良母性遗传性状的多倍体罗汉果植株，成本低、诱导速率和诱导率高、培育周期短，得到质量较高的多倍体苗。

技术领域

本发明涉及植株培育技术领域，尤其是涉及多倍体罗汉果植株的培育方法。

背景技术

罗汉果隶属于葫芦科，罗汉果属，为多年生草质藤本植物，是我国特有的药用和甜料植物，不仅是药典收载的中药品种，也是卫生部、国家中医药管理局列入第一批既是食品又是药品名录的中药。果实营养价值很高，含丰富的维生素C以及糖甙、果糖、葡萄糖、蛋白质、脂类等，罗汉果甜苷是一种低热量高甜度的天然甜味剂，其甜度堪称世界之最，且低热、无毒，可为糖尿病和肥胖病患者等食用。罗汉果甘、酸、性凉，具有清热凉血、生津止咳、滑肠排毒、嫩肤益颜、润肺化痰等功效，是广西著名的道地药材。罗汉果甜苷存在于果实的果肉和果皮中，但是不含甜苷成分的种子占整果的50%，种子内的油脂增加了罗汉果甜苷提取、纯化的难度和成本。罗汉果种籽多的缺陷造成了甜苷得率低的问题，且很难通过改进提取工艺来解决，使得甜苷价格昂贵，仅能在高端产品中使用。这一问题制约了罗汉果种植业及其加工业的发展。采用现代生物技术培育结籽减少或无籽、甜苷含量高的优良罗汉果品种对于推动罗汉果产业的发展具有里程碑意义。

植物多倍体中含有较多的染色体组数，往往在体型上表现出巨大性和高抗逆境能力，而且多倍体植物在品质和生物量上，都较二倍体优越。特别是植物三倍体具有不育的特性，是解决罗汉果多籽缺陷的最有效途径。无籽罗汉果的培育，将大幅提高甜苷含量和整果利用率，有效解决甜苷价格昂贵的问题，使罗汉果更广泛的应用于饮料、食品、保健品、药品等行业。目前的无籽罗汉果技术都是用二倍体罗汉果雄株与三倍体罗汉果雌株进行杂交，获得无籽罗汉果，该技术获得的罗汉果果实严重变小、变短，目前市场上罗汉果的价格以其性状和大小来区分，因此该技术在生产中无法应用。培育果形大、甜苷含量高的无籽罗汉果是解决目前无籽罗汉果推广应用的根本方法。

现有技术如授权公告号为CN 104542278 B的中国发明专利，公开了一种多倍体罗汉果植株的培育方法，应用MS诱导丛芽液体培养基培养罗汉果雌/雄株的叶片或者茎部获得罗汉果丛芽，以用于制备多倍体罗汉果植株，其中，在培养之前，需要将罗汉果雌/雄株的叶片或者茎部进行表皮细胞划伤处理。上述培育方法能够快速、高效获得具有优良母性遗传性状的多倍体罗汉果植株，成本低、效率高、品种好，实现罗汉果雌/雄株染色体加倍，获得的多倍体罗汉果植株多为制备四倍体，其与二倍体罗汉果雄/雌株杂交获得三倍体无籽品种，具有重要的农业、医药指导意义。但是该培养方法用MS诱导丛芽液体培养基对罗汉果组织的渗透作用稍弱，使得多倍体的诱导率不太理想。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够快速、高效获得具有优良母性遗传性状的多倍体罗汉果植株，成本低、诱导速率和诱导率高、培育周期短，得到质量较高的多倍体苗的多倍体罗汉果植株的培育方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

多倍体罗汉果植株的培育方法，包括诱导培养、转接培养、生根培养、纯化培养、扩大培养，其中诱导培养用培养基中含有甘露醇，甘露醇中含有L-甘露醇。该特殊甘露醇的使用一方面可维持薄壁细胞的稳定，避免破裂，且促进薄壁细胞再生细胞壁并继续分裂，能够保证薄壁细胞的成活率，提高诱导成功率和所得罗汉果丛芽的数量，另一方面还能引起基因组的核苷酸碱基序列改变，形成可与引物杂交的新位点，使后续得到的多倍体罗汉果雌株在抗逆性及光合能力方面更优于其二倍体植株，且能提高MS诱导培养基对罗汉果茎尖组织的渗透性强，提高多倍体的诱导速率和诱导率。