[发明专利]G四聚体共价偶联DNA分子和DNA自转染试剂盒及应用

权利要求书

1.一种G四聚体共价偶联DNA分子，中间的双链是待转染DNA片段双链，每条链的5’端各由9个胸腺嘧啶(T)链连接的G-四聚体，Gq-DNA的核酸序列：链1：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttTTTTGCTCACATGTTCTTTC；

链2：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttNNN……NNN；

链3：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttATTTACGCGTTAAGATA；

链4：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttNNN……NNN；

链1或链2的9个胸腺嘧啶(T)前的富鸟嘌呤(G)序列与链3或链4的富鸟嘌呤(G)序列相互结合形成G四聚体，链3和链4的NNN……NNN部分互补配对形成双链,链3和链4的NNN……NNN为待转染DNA。

2.根据权利要求1所述G四聚体共价偶联DNA分子的合成方法，首先将待转染基因构建到真核细胞过表达载体上，然后设计引物1进行常规PCR，得到启动子+待转染基因的DNA线性片段；以片段为模板，再设计一对引物2，引物2的上游引物5

-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTT GATTGGGAAGAGAATAGCAGGCAT-3下游引物

5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTT GCTACAGGGCGCGTACTATGGTT-3，其5’端带有核仁素亲和Gq前体序列5’

-(GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)-3’，用带有前体G q序列的引物2：5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3单独进行单链分步PCR，分别得到两端含有前体Gq序列的两条单链，其中N为与模板配对碱基序列；然后测量两种产物的浓度，并按照1:1的比例混合，然后加入5×Annealing buffer，混匀，95℃5min，缓慢降温至常温，退火得到G四聚体共价偶联DNA分子。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述基因为DNA片段。

4.根据权利要求2或3所述的合成方法，其特征在于：所述表达载体上为pCMV-tag2A；引物1的上游引物为5-TTTTGCTCACATGTTCTTTC-3，下游引物为5-ATTTACGCGTTAAGATA-3；引物2的上游引物为5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttTTTTGCTCACATGTTCTTTC-3，下游引物为5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttATTTACGCGTTAAGATA-3。

5.一种DNA自转染试剂盒，其特征在于：包括聚凝胺、5×Annealing buffer和权利要求1所述的G四聚体共价偶联DNA分子。

6.权利要求5所述DNA自转染试剂盒在转染肿瘤细胞中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述肿瘤细胞为肝癌细胞。

8.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于：将G四聚体共价偶联DNA分子和聚凝胺加入肿瘤细胞，在使用过程中，通过聚凝胺中和掉DNA和细胞膜上的负电荷之后，G四聚体共价偶联DNA分子与细胞膜表面的核仁素结合，在核仁素的穿梭运动下被带入细胞核。