[发明专利]G四聚体共价偶联DNA分子和DNA自转染试剂盒及应用

说明书

本发明涉及一种G四聚体共价偶联DNA分子，中间的双链是待转染DNA片段双链，每条链的5’端各由9个胸腺嘧啶（T）链连接的G‑四聚体。本发明还提供了一种DNA自转染试剂盒，包括聚凝胺、5×Annealing buffer和所述的G四聚体共价偶联DNA分子。本发明用于肿瘤细胞的靶向DNA转染，将待定用途的基因或者DNA片段选择性转染进肿瘤细胞。所述转染操作简便、高效低毒、不依赖与细胞周期、操作简单、成本低。

技术领域

本发明涉及一种DNA转染技术，尤其是G四聚体共价偶联DNA分子和DNA自转染试剂盒及应用。

背景技术

转染指的是将外源的核酸导入细胞的过程，目前的转染方法主要有三类，分别是物理、化学和生物途径，物理途径主要指电转法，显微注射法，均需要设备才能实现转染，而且电转法细胞存活率低，显微注射法操作复杂，设备昂贵。化学途径主要包括阳离子脂质体，阳离子聚合物和磷酸钙等类型的转染试剂，均需要依赖细胞的内吞作用，阳离子脂质体法虽然应用范围广，但是有一定的细胞毒性，而且对DNA的浓度有要求，DNA浓度过高会影响转染效率，磷酸钙法重复性差，且对DNA的浓度要求高，而且包括阳离子聚合物在内的试剂均依赖于细胞的有丝分裂。生物途径主要包括逆转录病毒法，虽然这种方法转染效率高，但是其有免疫原性，而且只感染分裂的细胞。因此，需要有一种高效低毒、不依赖与细胞周期、操作简单、低成本的转染方法。

核仁素在所有真核细胞均会表达，是细胞核仁中最主要的一种蛋白，主要参与核糖体的成熟装配与转运，可以调控细胞增殖和细胞凋亡，在细胞内也可以作为一种穿梭蛋白，在细胞核和细胞浆之间穿梭，甚至可以表达在某些细胞表面，如肿瘤细胞，免疫细胞，作为某些分子，细菌或者病毒的受体。核仁素还可以特异性的结合鸟嘌呤四聚体（G-四聚体，G-quadruplex,以下简称Gq）。 Gq是由富含鸟嘌呤的DNA 链缠绕折叠形成的，四个鸟嘌呤之间通过 Hoogsteen氢键形成四聚体结构。

发明内容

为了克服现有技术中的一些缺点，本发明提供一种G四聚体共价偶联DNA分子和DNA自转染试剂盒及应用，可以提供一种高效低毒、不依赖于细胞周期、操作简单、低成本的转染方法。

我们利用Gq可以特异性结合核仁素，以及核仁素的穿梭特性，发明了本试剂盒。我们首次发明利用Gq来进行DNA的自转染，并首次开发出线性单链分步PCR法。待转染DNA片段经线性单链分步PCR法扩增后，形成不完全双链DNA—即两端带有富含G的单链，中间是完整的待转染DNA片段双链；之后经退火,富含G的单链与游离富含G的单链形成Gq；最终得到两端是Gq中间是DNA双链的嵌合体。这种嵌合体，因两端的Gq与核仁素的亲和能力促进待转染DNA片段进入细胞并进入细胞核。

本发明提供的技术方案是：一种G四聚体共价偶联DNA分子，中间的双链是待转染DNA片段双链，每条链的5’端各由9个胸腺嘧啶（T）链连接的G-四聚体。

所述G四聚体共价偶联DNA分子的合成方法，首先将要转染的基因构建到真核细胞过表达载体上，然后设计引物1进行常规PCR，得到启动子+待转染基因的DNA线性片段；以片段为模板，用带有前体Gq序列的引物2 5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGttttttttttNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3的上游引物及下游引物各自单独进行线性单链分步PCR，简称线性PCR,分别得到两端含有前体Gq序列(5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3)的两条单链，其中N为与模板配对碱基序列，作为PCR的引物，称为PCR靶序列；然后测量两种产物的浓度，并按照1:1的比例混合，然后加入5×Annealing buffer，混匀，95℃ 5min，缓慢降温至常温，退火得到G四聚体共价偶联DNA分子，称为Gq-DNA。

以此方法合成Gq-DNA为技术基础，发明一种DNA自转染试剂盒，包括聚凝胺、5×Annealing buffer和上述DNA分子。