[发明专利]催化合成可可碱的酶组合物及其在生物制备可可碱中的应用

说明书

本发明提供一种催化合成可可碱的酶组合物和生物制备可可碱的方法，属于可可碱制备技术领域。本发明提供了催化合成可可碱的酶组合物，包括NdmA酶和NdmD酶；所述NdmA酶的一级结构氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述NdmD酶的一级结构氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。采用本发明提供的酶组合物对咖啡因进行催化反应得到可可碱，具有转化率高的特点，对咖啡因的转化率大于90％。本发明提供的酶组合物具有较好的工业化应用前景。

技术领域

本发明属于可可碱制备技术领域，具体涉及一种催化合成可可碱的酶组合物和生物制备可可碱的方法。

背景技术

可可碱(Theobromine)，是一种甲基黄嘌呤类生物碱。主要存在于可可树和巧克力中(Narendra K S,Trilok C B,Namratha S,et al.Production oftheobromine fromPsudeomonas sp.Int Res J Pharm,2013,4(2):151-154)，呈白色单斜形针状结晶性粉末，略有苦味。可可碱可以作为磷酸二酯酶抑制剂，弱腺苷受体拮抗剂，具有较强和持久的利尿作用，有较强的扩张冠状动脉、兴奋心肌、松弛气管平滑肌的作用。可可碱也是一种重要的药物中间体，如己酮可可碱对脑血管疾病、糖尿病并发症有显著疗效。可可碱在国内主要作为复方制剂销售，可以制成止咳平喘药物。

目前，可可碱主要是从可可豆或可可豆壳中抽提或采用化学合成方法获得，但由于可可豆或可可豆壳中可可碱的含量仅1％左右，化学抽提不仅效率低，而且大量有机溶剂的使用也造成安全上的隐患和环境的污染。而化学合成法是以甲基脲和氰乙酸乙酯为起始原料经缩合、亚硝化、还原、甲酰化、甲基化环合反应，得到粗品，再重结晶而得到纯品，因此，该方法反应步骤多、反应过程复杂、副反应多且易造成环境污染。而生物催化法以其环境友好、反应条件温和、对底物专一等优点逐渐成为了可可碱制备最具前景的研究方向。

可可碱，即3,7-二甲基黄嘌呤，其连同副黄嘌呤(Paraxanthine)和茶碱(Theophylline)，均属咖啡因(Caffeine)的去甲基代谢产物，即对咖啡因(1,3,7-三甲基黄嘌呤)分别脱去了N-1、N-3、N-7位甲基。因此，可可碱与咖啡因的区别便在于1位是否甲基化。于是，利用生物催化法制备可可碱的关键，便在于寻找可以专一性降解咖啡因N-1位甲基的微生物或生物酶制剂。

目前，国内外关于生物催化方法合成可可碱的相关报道很少。1994年，Yasuhisa等报道从恶臭假单胞菌352株中可分离具有脱甲基活性的酶混合物(Yasuhisa A,ToshihiroK,Hideaki Y.Enzymes involved intheobromine production from caffeine byPseudomonas putidaNo.352.Biosci Biotech Biochem,1994,58(12):2303-2304)。2001年Sideso等也从恶臭假单胞菌分离到咖啡因脱甲基活性酶复合体(Sideso O F P,MarvierAC,Katerelos N A,et al.The characteristics and stabilization of a caffeinedemethylase enzymecomplex.IntJ Food Sci Technol,2001,36:693-698)。2011年Gummadi等报道其催化相关酶主要为咖啡因脱甲基化酶，属于单加氧酶，这类酶具有不同位置脱甲基特异性(Gummadi S N,Bhavya B.Enhanced degradation of caffeineandcaffeine demethylase production by Pseudomonas sp.inbioreactors underfed-batchmode.ApplMicrobiolBiotechnol,2011,91:1007-1017)。