[发明专利]一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法在审
| 申请号： | 201810663764.7 | 申请日： | 2018-06-25 |
| 公开（公告）号： | CN108796048A | 公开（公告）日： | 2018-11-13 |
| 发明（设计）人： | 陆燕;余梦倩;刘鹏渊;周莉媛 | 申请（专利权）人： | 浙江大学医学院附属妇产科医院 |
| 主分类号： | C12Q1/6851 | 分类号： | C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 杭州求是专利事务所有限公司 33200 | 代理人： | 刘静;邱启旺 |
| 地址： | 310000 *** | 国省代码： | 浙江;33 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 核苷酸差异 分辨 接头序列 片段末端 性逆转 引物 检测 退火 生物学功能 发夹结构 检测探针 接头连接 引物序列 重要意义 作用机制 步形成 逆转录 分辨率 变性 变体 体内 研究 | ||
1.一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据不同tRF序列设计特异性接头序列，当tRF序列为tRF5时，通过3’-Db-接头与tRF5的3’末端相连接；当tRF序列为tRF3时，通过5’-Db-接头与tRF3的5’末端相连接；同时设计特异性逆转录引物并在跨接头处设计用于TaqMan qPCR检测的TaqMan探针以及上下游扩增引物；
(2)连接接头：取RNA样品100-1000ng与20pmol步骤(1)所述特异性接头序列混合，与退火缓冲液形成10μl体系，于95℃变性3分钟，自然降温2小时退火后使用T4 RNA连接酶于37℃孵育1小时，4℃连接过夜以形成稳定的末端发卡结构，从而得到接头RNA；
(3)特异性逆转录引物的逆转录反应：使用逆转录试剂盒，将步骤(2)所述接头RNA与步骤(1)所述特异性逆转录引物混合配制逆转录体系，反应形成逆转录产物；
(4)TaqMan qPCR检测：使用TaqMan qPCR试剂盒，在步骤(3)所述逆转录产物中加入步骤(1)所述TaqMan探针以及上下游扩增引物，混合配制qPCR扩增体系，采用相对定量法根据CT值计算目标tRF的表达量。
2.根据权利要求1所述的一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述特异性接头序列为：
3’-Db-接头：
/5Phos/XTCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGAYNNNNNN，其中X、Y互为配对碱基，N为与目的tRF5序列连接端的最后6个碱基互补配对的碱基；
5’-Db-接头：
MMMMMMCTCAGTGCATGGGAGGGTGTGTGGTCTTGCTTGGTGTGCACTGrArG，其中M为与目的tRF3序列连接端的最后6个碱基互补配对的碱基。
3.根据权利要求1所述的一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述特异性逆转录引物序列为：适用于3’-Db-接头体系的序列为XTCAGTGCGAATACCTCGGACCCT；适用于5’-Db-接头体系的序列为TaqMan qPCR扩增体系的下游引物。
4.根据权利要求1所述的一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中使用的逆转录试剂盒为PrimeScriptTM RT reagent Kit(Takara)。
5.根据权利要求1所述的一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中使用的TaqMan qPCR试剂盒为Premix Ex TaqTM(ProbeqPCR)试剂盒(Takara)。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于浙江大学医学院附属妇产科医院，未经浙江大学医学院附属妇产科医院许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201810663764.7/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
