[发明专利]一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法

说明书

本发明公开了一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法，包括以下步骤：(1)特异性接头序列、特异性逆转录引物与检测探针和引物序列的设计；(2)接头连接：在RNA中加入步骤(1)中设计的特异性接头序列，经过变性、退火、连接三步形成特异性末端环状发夹结构；(3)步骤(2)所述接头RNA与步骤(1)所述特异性逆转录引物混合进行逆转录；(4)TaqMan qPCR检测。本发明基于TaqMan qPCR方法，为生物体内tRF的研究提供了一种有效且便捷的可精确分辨不同tRF变体的方法，分辨率可精确至单个核苷酸差异，这对于全面深入研究tRF的生物学功能和作用机制具有有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物检测技术、细胞生物学和分子生物学领域，具体涉及一种可以精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法。

背景技术

tRNA来源片段是大量存在于生命有机体中的一类小片段非编码RNA，这些小RNA既可以由Dicer或RNase Z等酶切割tRNA产生，也可以在应激状态下产生，如饥饿、低氧状态或是血管生成素的影响。研究表明机体内某些应激诱导的tRF介导应激反应，从而导致应激微粒的组装，抑制蛋白质的合成；此外，一些tRF可以影响一系列的细胞功能，例如影响癌细胞的增殖和转移、介导重要信号通路中RNA分子的失活等。

根据tRF的产生方式及其与成熟tRNA或前体tRNA匹配的位置可以将tRF分为以下几类：1)在应激状态下产生，在成熟tRNA的反密码子环处被切割产生的31-40个碱基长度的tRF称为tiRNA，包括5’tiRNA，即从成熟tRNA5’末端开始到反密码子环为止；3’tiRNA，即从成熟tRNA 3’末端开始到反密码子环为止；2)与miRNA相似，拥有5’末端磷酸基团和3’末端羟基基团，长度在14-30个碱基，根据其与tRNA序列的匹配位置包括产生于成熟tRNA5’末端的tRF5、产生于成熟tRNA3’末端的tRF3和产生于前体tRNA3’末端的tRF1。

随着研究的深入，研究者们发现tRF在细胞的分化、发育、增殖等生命过程中的作用越来越重要，其生物学功能和分子机制的研究越来越受到人们的重视，因此精确检测特定tRF是深入研究其功能的重要的第一步。目前对于tRFs的研究，采用的最普遍的检测方式主要有两种：1)Northern Blot：此方法的优势在于它特异性高，可检测目的片段的大小以及是否具有可变剪切出现，但是由于此法可允许探针的部分不配对性，也导致其对来源于同一tRNA的不同长度的tRF，尤其是1-2个碱基差异的tRF的分辨率降低，同时此方法与qPCR相比灵敏度较低、操作繁琐、对RNA无酶操作要求更高，使得其不适于tRF的大批量检测；2)在目标tRF 3’末端加poly(A)尾后与一段带有oligo(dT)的连接序列退火形成一段更长的RNA，从而用qPCR检测，此方法简便、快速，但是特异性较低，无法精确分辨来源于同一tRNA的不同长度的tRF，尤其是1-2个碱基差异的tRF。因而本领域仍需要一种可以精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异、并且操作简便灵敏度高的检测方法。

发明内容

本发明旨在提供一种高分辨率的检测方法来鉴定不同类型或者同一类型不同长度的tRF。本发明鉴于现有Northern Blot和qPCR方法的缺陷，所提供的方法不仅可以减少操作的繁琐，提高灵敏度，而且可以提高特异性，使得分辨率高达一个碱基的差异。

本发明所提供的技术方案：一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)根据不同tRF序列设计特异性接头序列，当tRF序列为tRF5时，通过3’-Db-接头与tRF5的3’末端相连接；当tRF序列为tRF3时，通过5’-Db-接头与tRF3的5’末端相连接；同时设计特异性逆转录引物并在跨接头处设计用于TaqMan qPCR检测的TaqMan探针以及上下游扩增引物；所述特异性接头序列为：

3’-Db-接头：