[发明专利]一种在大肠杆菌中利用果糖合成D-塔格糖的方法

权利要求书

1.一种在大肠杆菌中利用果糖合成D-塔格糖的方法，其特征在于：所述方法步骤如下：

1)将根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因FbaA的密码子以及基因HXK的密码子构建在质粒pET28a上，得到重组质粒1，重组质粒1pET28a-HXK&FbaAs上带有大肠杆菌的卡那霉素抗性基因；

2)将根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因appA的密码子构建在质粒pET22b上，得到重组质粒2，重组质粒2pET22b-appA上带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性基因；

3)敲除大肠杆菌中的T6P的糖磷酸转运蛋白UhpT，得到ΔUhpT的大肠杆菌的菌株Taga-ΔUhpT；

4)将上述重组质粒1和重组质粒2同时转入经过改造的Taga-ΔUhpT菌株中，根据卡那霉素抗性基因和氨苄霉素抗性基因筛选阳性克隆，然后提取大肠杆菌的质粒进行PCR验证，得到最终的发酵菌株Taga-ΔUhpT-HXK-FbaA-appA；

5)基于步骤4)发酵菌株Taga-ΔUhpT-HXK-FbaA-appA进行全细胞催化合成塔格糖。

2.根据权利要求1所述的在大肠杆菌中利用果糖合成D-塔格糖的方法，其特征在于：步骤5)中全细胞催化合成塔格糖的具体操作如下：

51)在添加了相应抗性的LB液体培养基中，隔夜培养发酵菌株，使构建好的发酵菌株活化；

52)将上一步活化后的发酵菌株转接至添加了相应抗性的LB液体培养基中，培养至OD600≥1；

53)将上一步中的菌液按1％的接种量转入2YT培养基中，培养至OD600＝0.7-1.0；

54)加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导，培养16h-18h，培养温度为16-18℃，220-250rpm，然后发酵液冷却至4℃，4200-5000rpm收集菌液；

55)将收集的菌液用磷酸盐buffer悬浮，进行20倍的浓缩；

56)添加相应的底物果糖，37-39℃，220-250rpm反应24-36h，收集产生的D-塔格糖。

3.根据权利要求2所述的在大肠杆菌中利用果糖合成D-塔格糖的方法，其特征在于：步骤51)和52)中，LB培养基的质量分数组成为：1％的胰化蛋白胨，0.5％的酵母抽提物，1％的NaCl，用NaOH调pH值至7.5，121℃灭菌20min备用。

4.根据权利要求3所述的在大肠杆菌中利用果糖合成D-塔格糖的方法，其特征在于：步骤51)和52)中培养温度37-39℃，转速210-230rpm。

5.根据权利要求2所述的在大肠杆菌中利用果糖合成D-塔格糖的方法，其特征在于：2YT培养基的质量分数组成为：1.6％的胰化蛋白胨，1％的酵母抽提物，0.5％的NaCl，121℃灭菌20min备用。

6.根据权利要求5所述的在大肠杆菌中利用果糖合成D-塔格糖的方法，其特征在于：步骤53)中培养温度37-39℃，转速210-230rpm。