[发明专利]一种在大肠杆菌中利用果糖合成D-塔格糖的方法

说明书

本发明涉及一种在大肠杆菌中利用果糖合成D‑塔格糖的方法，步骤如下：1)将FbaA的密码子以及基因HXK的密码子构建在质粒pET28a上，得到重组质粒1，重组质粒1上带有大肠杆菌的卡那霉素抗性基因；2)将根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因appA的密码子构建在质粒pET22b上，得到重组质粒2，重组质粒上带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性基因；3)敲除大肠杆菌中的T6P的糖磷酸转运蛋白UhpT，得到ΔUhpT的大肠杆菌的菌株；4)将上述重组质粒1和重组质粒2同时转入经过改造的菌株中，根据卡那霉素抗性基因和氨苄霉素抗性基因筛选阳性克隆，得到最终的发酵菌株；5)全细胞催化合成塔格糖。本发明在微生物体内进行生物酶的催化合成，生产成本和对环境友好方面容易控制。

技术领域

本发明涉及一种在大肠杆菌中利用果糖合成D-塔格糖的方法，属于合 成生物学领域。

背景技术

稀少糖(Rare Sugar)是自然界中存在但含量极少的一类单糖(糖的最 小单位)和糖醇，和自然界大量存在的葡萄糖和果糖相比，非常稀少，约 有50个种类。其味类似于蔗糖，但具有热量低、稳定性高、甜味协调、无 吸湿性、无致龋齿性、耐受性高等优点，可以弥补传统甜味剂的不足，被 广泛应用于保健食品、婴幼儿配方食品，乳制品，饮料等食品中，尤其对 改善特殊人群的饮食起到重要作用。稀少糖的益处还有很多，例如可以减 少有毒物质(如内毒素、氨类等)的形成，对肠粘膜细胞和肝具有保护作 用，可以调节肠道菌群，让某些微生物定植于肠道，并为其提供适宜的栖 息环境，促进肠黏膜免疫功能的完善和影响、参与人体的多种代谢功能， 从而防止病变肠癌的发生，增强机体免疫力。

D-塔格糖是稀少糖的一种，近年被发现的一种具有特殊保健功能的功能 甜味剂，其甜度与蔗糖相似，而产生的热量只为蔗糖的1/3，所以被称之为 低热量甜味剂，具有能量低，可改善肠道菌群，降低血糖，抗龋齿等功 能。2001年被美国食品与药物管理局(U.S.Food and Drug Administration， FDA)确定为普遍公认安全食品(GRAS)。随后D-塔格糖在美国被通用于 健康饮料及酸乳、果汁等产品，作为蔗糖的代用品。同时还被广泛应用于 糖尿病专用食品、减肥食品、口香糖、谷物食品、饮料、肉制品、糖果等 工业中，并在医药中被用于咳嗽糖浆、粉剂、起泡剂、固定假牙的豁合剂 及口腔消毒剂中。目前D-塔格糖在国际市场上的市场份额正逐年增加，国 内市场还正在发展，由于中国人口基数大，糖尿病患者高居世界首位，功 能性甜味剂市场广阔等，D-塔格糖在中国市场上具有极大的潜力。

目前，D-塔格糖的合成方法主要是化学催化合成法和生物转化法，化学 催化合成法是以半乳糖为原材料，通过金属氢氧化合物(常为Ca(OH)₂) 以及碱金属催化剂(常为CaCl₂)催化半乳糖生成D-塔格糖-Ca复合物，再 通过酸中和将塔格糖从复合物中释放出来，该方法具有原材料较贵、产生 化学污染物、碱性条件副产物多、分离困难等诸多缺点。而生物转化法是 通过L-阿拉伯糖异构酶将半乳糖转化为塔格糖，但同样该反应具有原材料 较贵、转化效率低、产物分离难度大等缺点，很难实现工业化大规模生产。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种利用大肠杆菌从果 糖高效合成塔格糖的生物合成方法，该方法转化效率高、无污染、生产周 期短、成本低、可持续生产及环境友好。

本发明的目的通过一下技术方案实现，具体路线见说明书附图1。

D-塔格糖的生物合成工艺路线是以果糖为原料，经过HXK、FbaA和 appA生物酶的催化作用合成D-塔格糖见附图1，全过程在发酵罐中进行， 对环境友好，无污染。

在大肠杆菌中利用果糖合成塔格糖，具体过程如下：

1)将根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因FbaA的密码子以及基因 HXK的密码子，这两个基因的密码子构建在质粒pET28a上，得到重组 质粒1，重组质粒1：pET28a-HXK&FbaAs上带有大肠杆菌的卡那霉素 抗性基因，见附图1；