[发明专利]同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR方法及其引物和试剂盒

权利要求书

1.同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测引物组，其特征在于包括六对PCR引物，它们分别针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV 5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH，所述六对PCR引物分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.12的碱基序列，其中奇数序列为正向引物，偶数序列为反向引物；所述多重RT-PCR检测引物组还包括通用接头引物序列Tag-F序列和Tag-R序列，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.13至SEQ.ID.NO.14的碱基序列。

2.含有权利要求1所述引物组的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括以下试剂：阳性对照、阴性对照和权利要求1所述引物组。

4.根据权利要求3所述的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为含有SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV 5种甘蔗病毒的甘蔗总核酸标准品；阴性对照为无病毒甘蔗总核酸；所述引物组为：①预混的针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH的反转录引物组(RT Primer Mix，RPM)，其为针对上述病毒和内参基因GAPDH的权利要求1中所述反向引物的混合液，以及②预混的针对上述病毒和内参基因GAPDH的PCR引物组(Forward Primer Mix)，其为权利要求1所述所有正向引物和接头引物的混合液。

5.利用权利要求1所述引物组的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测方法。

6.根据权利要求5所述的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于所述反转录产物按以下方法制备：采用cDNA第一条链合成试剂盒，以提取的待测甘蔗样品的病毒核酸为模板，在20μL反应体系中加入所有反向引物的混合液RPM，使每条反向引物的终浓度为500nM，反转录制备cDNA模板；反转录体系为20μL，包括病毒核酸2μL，dNTP Mix 4μL，10×RPM 2μL，5×Super RT Buffer 4μL，Super RT 1μL，RNase-Free Water 7μL；反应程序为PCR仪上42℃50min，85℃5min。

7.根据权利要求6所述的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于PCR的反应体系为：共25μL，包括反转录产物8μL，Forward Primer Mix 2μL，10×Multi HotStart Buffer 2.5μL，Super Pure dNTPs 2μL，MgCl₂ 2μL，DNA polymerase 0.5μL，ddH₂O 6μL；其中Forward Primer Mix中每条正向引物的终浓度为200nM；PCR反应程序为：95℃预变性15min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；最后72℃延伸5min。