[发明专利]同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR方法及其引物和试剂盒

说明书

本发明公开了同时检测5种甘蔗病毒的多重RT‑PCR检测引物组，包括六对PCR引物，分别针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV 5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。据此，还对影响多重RT‑PCR扩增的引物浓度和退火温度等方面进行多重RT‑PCR体系的优化，建立了相应多重RT‑PCR检测方法，该法能够快速、准确又简便和经济地从甘蔗组织中同时检测这五种侵染甘蔗的病毒，对健康种苗母株筛选、健康种苗繁育监测、抗病育种和田间病害流行预测均具有重要意义。为方便应用本发明，还设计组装了相应试剂盒，以便在基层普及推广。

技术领域

本发明属于甘蔗病毒检测技术领域，涉及一种同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR方法及其引物和试剂盒。

背景技术

甘蔗(Saccharum officinarum L.)属禾本科甘蔗属植物，是最重要的糖科作物，同时也是乙醇、糖醛和葡聚糖的生产原料，甘蔗糖占我国食糖生产总量85％以上。甘蔗在生长过程中会受到多种病害尤其是病毒病的危害，经过长期无性繁殖留种，甘蔗品种和种质材料中会积累各种病毒，导致甘蔗品种退化、产量和糖分降低，给甘蔗产业造成重大的经济损失。世界范围内发现侵染甘蔗的病毒种类超过15种，包括DNA病毒类的甘蔗杆状病毒(Sugarcane bacilliform virus，SCBV)和甘蔗线条病毒(Sugarcane streak virus，SSV)及RNA病毒类的甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)、高粱花叶病毒(Sorghummosaic virus，SrMV)、甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV)、甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV)、玉米线条病毒(Maize streakvirus，MSV)、玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus，MCMV)、拉姆矮化病毒(Ramu stunt virus，RmSV)、甘蔗白条纹病毒(Sugarcane white streak virus，SWSV)、甘蔗斐济病毒(Sugarcane Fiji disease virus，SFDV)、甘蔗矮缩病毒(Sugarcane dwarfvirus，SDV)、香蕉线条病毒(Banana streak virus，BSV)、甘蔗褪绿线条病毒(Sugarcanechlorotic streak virus，SCSV)、甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane straite mosaic virus，SSMV)等。其中，我国大陆地区报道的有SCMV、SrMV、ScYLV、SCSMV、SFDV、SCBV、SCSV、MCMV。近年，广西全区进行的病毒病害调查显示，广西甘蔗种植区目前主要受SrMV，SCMV，ScYLV、SCBV和SSV五种病毒侵染。不同甘蔗病毒引起的症状不同，引发的症状包括植株束顶矮化、叶片中脉变黄、叶部斑点和斑驳、叶片皱缩、茎秆节间出现裂缝等。

基因检测是从核酸水平检测病毒，其检测的灵敏度和特异性均高于血清学检测，特别适用于准确性要求高的样本检测。目前甘蔗病毒的基因检测方法主要有PCR、RT-PCR、双链RNA(dsRNA)电泳和环介导等温扩增技术等，其中单重RT-PCR是目前应用最广泛的RNA病毒检测方法。但是单重RT-PCR一个反应只能检测一种病毒，如果反应模板中含有两个以上的病毒，则需进行多次PCR，成本高且费时费力。目前甘蔗病毒基因检测方法中，尚无同时检测两种及两种以上病毒的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、简便、经济且准确的同时检测5种甘蔗病毒(含两种DNA病毒和三种RNA病毒)的多重RT-PCR方法及其引物和试剂盒，可同时检测DNA病毒和RNA病毒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：