[发明专利]一种基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法及其应用

权利要求书

1.一种基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法，其特征在于，所述基因分型方法包括如下步骤：

(1)针对目标基因的基因序列SNP位点设计特异性引物；

(2)利用单管多重PCR扩增出包含目标基因特定SNP位点的目的片段；

(3)利用限制性内切酶消化PCR产物片段；

(4)进行单碱基延伸反应；

(5)进行脱盐纯化处理；

(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因特定SNP位点的基因序列。

2.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法，其特征在于，所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增一个或多个目标基因的基因序列SNP位点的特异性引物对，所述每个目标基因的基因序列SNP位点的特异性引物对包含一条正向引物和一条反向引物。

3.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法，其特征在于，所述步骤(2)中单管多重PCR扩增的反应程序为：98℃热启动，10分钟；95℃变性，30秒；56℃退火，30秒；72℃延伸，30秒；扩增40个循环；72℃终延伸，5分钟。

4.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法，其特征在于，所述步骤(3)中的限制性内切酶进行消化处理条件为：37℃消化处理45分钟，85℃加热变性5分钟，冰浴10分钟。

5.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法，其特征在于，所述步骤(3)中的限制性内切酶为碱性磷酸酶。

6.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法，其特征在于，所述步骤(3)中的碱性磷酸酶选自虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶、和大鼠碱性磷酸酶中的任意一种。

7.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法，其特征在于，所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括目标基因的基因序列SNP位点的单碱基延伸引物对，所述单碱基延伸引物对包含一条单碱基延伸正向引物和一条单碱基延伸反向引物。

8.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法，其特征在于，所述步骤(4)中单碱基延伸反应的反应程序为：95℃热启动，1分钟；95℃变性，5秒；52℃退火，5秒；80℃延伸，5秒；扩增40个循环；72℃终延伸，3分钟。

9.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法，其特征在于，所述步骤(6)的核酸质谱检测的具体步骤为：

(1)在树脂板上铺好待用树脂，风干5-10分钟；

(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充25ul ddH₂O，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；

(3)除去封口膜，将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；

(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟，再3000转/分钟离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。

10.根据权利要求1所述的基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法在单核苷酸多态性检测上的应用。