[发明专利]一种基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法及其应用

说明书

本发明涉及一种基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法及其应用。所述基因分型方法包括：(1)针对目标基因的基因序列SNP位点设计特异性引物；(2)利用单管多重PCR扩增出包含目标基因特定SNP位点的目的片段；(3)利用限制性内切酶消化PCR产物片段；(4)进行单碱基延伸反应；(5)进行脱盐纯化处理；(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因特定SNP位点的基因序列。上述基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法，检测准确性高、实验可重性高、通量大、成本低。本发明还提供了基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法在单核苷酸多态性检测上的应用，可以特异、简单的对目标基因或者病原微生物进行分型，大大提高了分型效率。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法及其应用。

背景技术

基因分型(Genotyping)是利用生物学检测方法测定个体基因型(Genotype)的技术。又称为基因型分析(Genotypic assay)，使用技术包括聚合酶链反应(PCR)、DNA片段分析、寡核苷酸探针(ASO probes)、基因测序、核酸杂交、基因芯片技术、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP)技术等。这些技术在基因分型和病原微生物检测有了广泛的应用。但是其缺点也很明显，一个的通量低，另外一个就是有的基因型没法检测，尤其是病原微生物的耐药检测。核酸质谱技术通过PCR扩增，单碱基延伸，最后产品打质谱可以同时检测20到30多个位点。但是，由于个别耐药病原菌，连续的SNP位点加大单碱基引物设计难度，没法检测足够多的型别。

单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，且这些变异在人群中所占比例>1％。单核苷酸多态性在遗传疾病的诊断和筛查以及用药种类及剂量指导等多方面有着及其重要的作用。目前，临床最为常用的SNP检测手段主要为Sanger测序、荧光定量PCR、低浓度基因芯片和焦磷酸测序等，这些技术大大推动了基因检测在临床医学中的应用。但是，随着人们对疾病机制和治疗手段不断深入的研究，临床对SNP检测的需求正在从单基因的有限几个位点逐步转移至多基因多位点。所以，虽然上述现有临床常用基因检测技术在实验操作，TAT时间、成本、数据分析难易度等方面各有利弊，但总体来说并不完全适合多基因多位点的检测需求。现有的荧光定量PCR法，基因芯片法和Sanger测序法都是基于化学(荧光)方法，依赖于核苷酸的互补性对核酸序列进行分析。因此对于序列的长度、复杂性、反应条件等都具有较高的要求，容易受到多种化学因素的影响，导致检测结果出现偏差。以荧光PCR方法为例，一旦基因突变位点出现在引物杂交区域，则有可能导致探针不能与模板正确结合，导致检测结果出现误差。在基因芯片中，也同样存在探针内突变位点导致杂交结果出现假阴性的现象，甚至还会引起二次杂交时候的不正确配对，导致出现废片，影响检测结果。相比之下，核酸质谱技术利用多重PCR技术，即1个反应管可同时检测多个SNP位点，可极大地提高多基因多位点的检测效率以及降低样本用量，满足临床需求。核酸质谱的方法则是根据核酸序列本身的核苷酸组成分子，以及其被电离后在真空管中的飞行时间来确定其分子量大小，最终确定核苷酸序列。其检测结果仅仅依赖于分子量这一物理参数。尤其是在SNP位点已经确定的条件下，采用核酸质谱的方法还可以将检测大幅度通量提高，可在同一反应体系内对多个SNP位点进行多重检测与分析，从而提高检测通量、效率与正确率。这样的检测方法无疑是对现有荧光PCR、基因芯片和测序等方法的重要补充。核酸质谱技术的基本原理是通过样品离子化，产生不同质荷比的离子，然后再经过质量分析器测定该样品中不同种类离子的分析量，并按照从小到大的顺序依次排列从而得到一幅质量图谱。

发明内容

基于此，有必要针对上述现有技术中的不足，提供一种基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法及其应用，通过将PCR扩增技术，限制性核酸内切酶和质谱技术进行结合，可以特异、简单的对目标基因或者病原微生物进行分型。

一种基于SNP位点核酸质谱检测的基因分型方法，所述基因分型方法包括如下步骤：