[发明专利]一种牙髓干细胞的分离培养方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种牙髓干细胞的分离培养方法。该分离培养方法包括如下步骤：采用含有I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的溶液对牙髓组织进行消化，过筛，清洗后得到牙髓干细胞；将牙髓干细胞接种至含有FGF、FBS的DMEM/F12培养基进行细胞培养，每3天换液一次，当细胞汇合度为75％～85％时进行传代培养。本发明采用I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶对牙髓组织进行消化，在维持细胞活力的同时，可充分消化牙髓组织，使牙髓干细胞游离出来，得到的牙髓干细胞数量多，且活力强。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种牙髓干细胞的分离培养方法。

背景技术

牙周炎是累及四种牙周支持组织(牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)的慢性感染性疾病，往往引发牙周支持组织的炎性破坏。在35岁以后较为多见。常见病因为菌斑、牙石、创伤性咬合、食物嵌塞、不良修复体、口呼吸等。牙周炎具有四大特征，即牙周袋形成、袋壁的炎症、牙槽骨吸收、牙齿逐渐松动。严重的牙周炎会造成牙齿脱落，从而导致咀嚼功能低下而引起消化不良及胃肠病，影响全身心的健康。治疗牙周炎的主要在于消除炎症，促进被破坏的牙周组织的再生，恢复牙齿的正常功能。临床常采用的牙周炎治疗方法包括：牙周基础治疗(洁治、刮治、根面平整)、牙周翻瓣术及牙周组织再生术。但这些方法无法修复损伤的牙周附着及牙槽组织，不能满足目前临床上对口腔颌面部组织缺损修复再生及功能、外形恢复的要求，其次牙周炎治疗通过抗生素来控制菌斑生长，进行全身和局部的药物治疗。但抗生素副作用较多，病原微生物也会产生耐药性。

牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是存在于牙齿牙髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。牙髓干细胞具有多向分化的潜能，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。据报道，牙髓干细胞在牙周炎治疗中可起到很好的修复作用，作用机制为：通过植入局部并分化为缺损细胞，分泌细胞因子，趋化干细胞到局部，抑制局部炎症，促进局部血管新生。

目前，常用的牙髓干细胞提取方法为采用I型胶原酶或者I型胶原酶与中性蛋白酶(又称分散酶)消化牙髓组织。但该法得到的牙髓干细胞总数量少，细胞活率低。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种牙髓干细胞的分离培养方法。该方法得到的牙髓干细胞数量多，且活力强。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种牙髓干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：

采用含有I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的溶液对牙髓组织进行消化，过筛，清洗后得到牙髓干细胞；

将牙髓干细胞接种至含有FGF、FBS的DMEM/F12培养基进行细胞培养，每3天换液一次，当细胞汇合度为75％～85％时进行传代培养。

作为优选，I型胶原酶的质量百分浓度为0.1％～0.5％，III型胶原酶的质量百分浓度为0.01％～0.2％，胰蛋白酶的质量百分浓度为0.01％～0.2％。

优选地，I型胶原酶的质量百分浓度为0.2％～0.4％，III型胶原酶的质量百分浓度为0.05％～0.15％，胰蛋白酶的质量百分浓度为0.05％～0.15％。

更优选地，I型胶原酶的质量百分浓度为0.3％，III型胶原酶的质量百分浓度为0.1％，胰蛋白酶的质量百分浓度为0.1％。

作为优选，I型胶原酶、III型胶原酶与胰蛋白酶的质量比为4:3:3～8:1:1。

优选地，I型胶原酶、III型胶原酶与胰蛋白酶的质量比为3:1:1。

作为优选，过筛的孔径为60～80μm。