[发明专利]一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法

权利要求书

1.一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：取样，取样9株耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌为样品，备用；

S2：耐药细菌DNA提取预处理，分别取耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌在1.5ml离心管中加入液氮预冷，并研磨均匀，加入650μl温度为60-70℃预热的CTAB溶液中；

S3：混匀冷却，将装有CTAB溶液和样品的离心管放入60-70℃的水中温浴，温浴时间0.4-0.6h，每15min混匀一次，冷却后，加入等体积的氯仿：异戊醇，混匀，转速为12000rpm条件下，离心14-16min；

S4：吸、弃上清，将S3中的液体样品，装入新EP管中，加入等体积氯仿：异戊醇，转速为12000rpm，离心14-16min，再转入新的离心管中，加入1/3体积的NaAc(3mol/L)，加入0.4-0.6ml异丙醇，混匀后置于-18～-22℃，时间0.4-0.6h，再将液体样品置于转速为12000rpm条件下，进行8-12min弃上清处理；

S5：洗涤溶解，向离心管中加入75％的乙醇洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干，再加入超纯水24-26μl溶解，即获得DNA提取物，并置于-18～-22℃条件下保存，备用；

S6：稀释样本，将S5中提取的样品稀释至总体积为28-32μl的样品；

S7：PCR反应，将样品按照每反应孔总体积为4-6μl进行PCR反应扩增；

S8：SAP反应，再加2μl SAP混液到每一个反应孔里，加混液后总体积7μl进行SAP反应扩增；

S9：延伸反应，每一个孔加入2μl iPLEX延伸混液并混好，加混液后总体积9μl进行延伸反应扩增；

S10：样本脱盐，把洁净树脂铺平在96/15mg dimple plate上，风干最少10min；

S11：点样到芯片上，用点样仪将样本点到对应的SpectroCHIP芯片上；

S12：数据分析，记录实验检测数据，并进行结果统计分析。

2.根据权利要求1所述的一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法，其特征在于：所述步骤S2中在加入650μl温度为60-70℃预热的CTAB溶液中之前加入0.18-0.22％的巯基乙醇。

3.根据权利要求1所述的一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法，其特征在于：所述步骤S3和步骤S4中氯仿：异戊醇的体积比均为24:1。

4.根据权利要求1所述的一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法，其特征在于：所述步骤S5中若琼脂糖凝胶电泳结果检测有RNA污染，再加入1-3μl RNase，上下倒置混匀，36-38℃条件下金属浴14-16min。

5.根据权利要求1所述的一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法，其特征在于：所述步骤S10中铺平方式是在样本板的每一个有样本的孔里加入40-42ul水然后离心，轻轻将样本板凌空反转，放在已放树脂的dimple plate上，然后将dimple plate连样本板一起反转，过程中两块板不可水平移动，让树脂掉到孔里，用膜把板封好，放在旋转器上颠倒摇匀28-32min，以2250g将板离心5min，采用标准板离心机，转速为3700rpm。

6.根据权利要求1所述的一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法，其特征在于：所述步骤S11中采用的点样仪型号为MassARRAY^TMRS 1000点样仪。