[发明专利]一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法

说明书

本发明公开了一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法，包括以下步骤：S1：取样；S2：耐药细菌DNA提取预处理；S3：混匀冷却；S4：吸、弃上清；S5：洗涤溶解；S6：稀释样本；S7：PCR反应；S8：SAP反应；S9：延伸反应；S10：样本脱盐；S11：点样到芯片上；S12数据分析。本发明严格控制该基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法，基于多基因耐药靶标检测有耗时短、准确性高的优点，该检测方法主要通过MassARRAY技术对耐药细菌的DNA进行快速检测，以9株耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌进行全基因组测序分析，20个SNP位点使用MassARRAY进行一次性检测，单个SNP位点检测符合度达95％，通量高过Sanger测序，所检测的位点数和基因数是Sanger测序200倍，大大缩短了耐药细菌的基因检测时间。

技术领域

本发明涉及细菌耐药检测技术领域，具体为一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法。

背景技术

细菌作为一类广泛存在的生物体，也可以通过多种形式获得对抗菌药物的抵抗作用，逃避被杀灭的危险，这种抵抗作用被称为“细菌耐药”，获得耐药能力的细菌就被称为“耐药细菌”。细菌耐药是一种被人类强化的自然现象。

在现有的细菌耐药检测技术中，有以下几种方法：(1)通过使用药物检测耐药细菌的抑制或杀灭情况，判断耐药细菌有可能存在的耐药表型；(2)通过PCR电泳逐个区段扩增耐药细菌的特定基因或特定基因片段；(3)通过逐个QPCR的方法进行耐药细菌的基因扩增检测特定基因；(4)通过Sanger测序技术对目标基因逐个测序从而检测某个基因突变情况，上述方法都存在耗时长、检测费用高等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法，基于多基因耐药靶标检测有耗时短、准确性高的优点，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法，包括以下步骤：

S1：取样，取样9株耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌为样品，备用；

S2：耐药细菌DNA提取预处理，分别取耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌在1.5ml离心管中加入液氮预冷，并研磨均匀，加入650μl温度为60-70℃预热的CTAB溶液中；

S3：混匀冷却，将装有CTAB溶液和样品的离心管放入60-70℃的水中温浴，温浴时间0.4-0.6h，每15min混匀一次，冷却后，加入等体积的氯仿：异戊醇，混匀，转速为12000rpm条件下，离心14-16min；

S4：吸、弃上清，将S3中的液体样品，装入新EP管中，加入等体积氯仿：异戊醇，转速为12000rpm，离心14-16min，再转入新的离心管中，加入1/3体积的NaAc(3mol/L)，加入0.4-0.6ml异丙醇，混匀后置于-18～-22℃，时间0.4-0.6h，再将液体样品置于转速为12000rpm条件下，进行8-12min弃上清处理；

S5：洗涤溶解，向离心管中加入75％的乙醇洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干，再加入超纯水24-26μl溶解，即获得DNA提取物，并置于-18～-22℃条件下保存，备用；

S6：稀释样本，将S5中提取的样品稀释至总体积为28-32μl的样品；

S7：PCR反应，将样品按照每反应孔总体积为4-6μl进行PCR反应扩增；

S8：SAP反应，再加2μl SAP混液到每一个反应孔里，加混液后总体积7μl进行SAP反应扩增；

S9：延伸反应，每一个孔加入2μl iPLEX延伸混液并混好，加混液后总体积9μl进行延伸反应扩增；

S10：样本脱盐，把洁净树脂铺平在96/15mg dimple plate上，风干最少10min；