[发明专利]一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法

权利要求书

1.一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，其包括：

以第一引物对作为砂糖桔黄龙病病原菌的分子检测引物，对待测样品基因组进行PCR扩增，确定患病植株DNA样品；

构建所述患病植株DNA样品的16SrDNA文库；

采用高通量测序技术对所述患病植株DNA样品进行检测并对所述患病植株DNA样品中的菌落组成进行分析。

2.根据权利要求1所述的感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，所述第一引物对的碱基序列如SEQ ID NO:1～2所示。

3.根据权利要求1所述的感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，构建所述患病植株DNA样品的16SrDNA文库的步骤包括：

以第二引物对为引物，对所述患病植株DNA样品进行16SrDNA PCR扩增，其中所述第二引物对的基因如SEQ ID NO:3～4所示；

再对扩增后的16SrDNA的各项指标进行检测，符合构建标准的入选16SrDNA文库。

4.根据权利要求3所述的感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，所述16SrDNA文库的所述构建标准包括：

a.入选所述16SrDNA文库中的DNA样品主带在10kb以上；

b.入选所述16SrDNA文库中的DNA样品的OD(260/280)值为1.6～1.8，OD(260/230)值大于2。

5.根据权利要求3所述的感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，所述16SrDNA PCR扩增的20μL反应体系包括：

正向引物(5μM)0.8μL，反向引物(5μM)0.8μL，FastPfu聚合酶0.4μL，模板DNA 10ng，2.5mM dNTPs 2μL，5×FastPfu缓冲液4μL，补双蒸水至20μL。

6.根据权利要求3所述的感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，所述16SrDNA PCR扩增的反应程序包括：

退火温度为54～56℃，延伸温度为70～74℃。

7.根据权利要求1所述的感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，经所述高通量测序技术测试得到的原始数据经数据拆分、引物序列的除去、拼接以及嵌合体的除去后，得到用于分析所述菌落组成的有效数据。

8.根据权利要求7所述的感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，所述有效数据中的碱基质量值大于20bp和30bp的碱基百分比均大于93％。

9.根据权利要求8所述的感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，所述拼接步骤包括：

将碱基数目低于20bp的read进行过滤处理；

将成对reads拼接组装一条序列；

根据序列首尾两端的barcode进行样品区分，同时进行序列方向调整。

10.根据权利要求9所述的感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，将所述对reads拼接组装时的参数为：最小重叠区域的长度为10bp；拼接序列的重叠区域允许的最大错配比率小于0.2。