[发明专利]对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法在审
| 申请号： | 201810682439.5 | 申请日： | 2018-06-27 |
| 公开（公告）号： | CN108795963A | 公开（公告）日： | 2018-11-13 |
| 发明（设计）人： | 赵美爱;宋希云;孙娇;杨小英 | 申请（专利权）人： | 青岛农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/31 |
| 代理公司： | 北京汇捷知识产权代理事务所(普通合伙) 11531 | 代理人： | 李宏伟 |
| 地址： | 266109 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 大肠杆菌 定向突变 构建 验证 同工酶基因 功能过程 克隆载体 基因 基因组 乙二醛 敲除 质粒 克隆 试验 | ||
1.对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，其特征在于按照以下步骤进行：
步骤1：克隆大肠杆菌gloA基因；
步骤2：构建克隆载体gloA/pSMART-LcKan；
步骤3：构建gloA/pSMART-LcKan质粒。
2.按照权利要求1所述对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，其特征在于：所述步骤1中所用引物
gloA△up F：ATCAAGCTTGAATTCGTTCAGGTATCGTCAATGATTTC
gloA△up R：GCAGGAGACTTTTTATCCTCAAAATGGC
gloA△down F：GGATAAAAAGTCTCCTGCCGGGCGTGAACT
gloA△down R：ATATCTAGAGAATTCGTCCAGCACAGCAGTGCGTTCGG。
3.按照权利要求1所述对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，其特征在于：所述步骤2中线性化pSMART-LcKan质粒方法如下，
pSmart-LcKan的ORI是pUC起源高拷贝，其中的rop基因是表达蛋白基因，采用Snapgene软件分析pSMART-LCKan载体序列，设计引物pSMART F/R进行载体线性化，引物信息如下：
pSMART F：GACGAATTCTCTAGATATCGCTCAATAC
pSMART R：AACGAATTCAAGCTTGATATCATTCAGG。
4.按照权利要求1所述对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，其特征在于：所述步骤3构建gloA/pSMART-LcKan质粒方法如下，
Gibson连接，需要在DNA片段的末端加上同源片段，然后将这些DNA片段和一种mastermix混合孵育，这种master mix含有三种不同类型的酶：一种外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合。一种聚合酶，用于修补gap一种DNA连接酶，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子，Gibson连接E.coli BL21 gDNAgloA△上下游序列与线性化的pSMART-LcKan PCR产物，从而构建gloA△/pSMART-LcKan。
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