[发明专利]对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法

说明书

本发明公开了对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，首先进行克隆大肠杆菌gloA基因；再构建克隆载体gloA/pSMART‑LcKan；最后构建gloA/pSMART‑LcKan质粒。本发明为了验证ZmGlyI基因的功能，排除大肠杆菌中乙二醛酶同工酶基因gloA对试验干扰，运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变，使之最终在验证ZmGlyI基因的功能过程中能够被敲除。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法。

背景技术

非生物胁迫是导致农作物减产的重要原因之一，非生物胁迫可以影响植物的各种生化、生化反应，例如矿物-营养平衡、渗透压的变化、激素转导平衡、光合作用等，甚至会抑制植物的生长及发育。玉米是全世界最重要的经济作物之一，同时也是饲料、生物能源的一个重要来源，为了验证ZmGlyI基因的功能，排除大肠杆菌中乙二醛酶同工酶对试验干扰，运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，通过构建pTargetF-gloA和gloAΔ/pSMART-LCKan载体，对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变，为了提高敲除效率，在Gibson克隆技术的基础上，通过多轮PCR反应，将两个gRNA连到gloA基因两侧导入同一个入门载体中，再将入门载体与含Cas9表达框的目标载体共电击转化，最终获得gloA缺失的大肠杆菌表达菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变的方法，本发明为了验证ZmGlyI基因的功能，排除大肠杆菌中乙二醛酶同工酶基因gloA对试验干扰，运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，对大肠杆菌gloA基因进行定点定向突变，使之最终在验证ZmGlyI基因的功能过程中能够被敲除。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

步骤1：克隆大肠杆菌gloA基因；

步骤2：构建克隆载体gloA/pSMART-LcKan；

步骤3：构建gloA/pSMART-LcKan质粒。

进一步，步骤1中所用引物

gloA△up F：ATCAAGCTTGAATTCGTTCAGGTATCGTCAATGATTTC

gloA△up R：GCAGGAGACTTTTTATCCTCAAAATGGC

gloA△down F：GGATAAAAAGTCTCCTGCCGGGCGTGAACT

gloA△down R：ATATCTAGAGAATTCGTCCAGCACAGCAGTGCGTTCGG。

进一步，步骤2中线性化pSMART-LcKan质粒方法如下，

pSmart-LcKan的ORI是pUC起源高拷贝，其中的rop基因是表达蛋白基因，采用Snapgene软件分析pSMART-LCKan载体序列，设计引物pSMART F/R进行载体线性化，引物信息如下：

pSMARTF：GACGAATTCTCTAGATATCGCTCAATAC

pSMARTR：AACGAATTCAAGCTTGATATCATTCAGG。

进一步，步骤3构建gloA/pSMART-LcKan质粒方法如下，