[发明专利]高纯度环孢菌素A及其制备方法

说明书

本发明公开了一种新的高纯度环孢菌素A及其制备方法。将环孢菌素A发酵液过滤，菌渣用乙醇浸提，浓缩，浓缩物加碱液处理，可除去大量杂质，同时有利于萃取分层。萃取液经脱色，结晶，得到纯度90％以上的粗品。粗品经柱层析、结晶纯化可得到纯度99.5％的环孢菌素A精品。本发明提供的方法操作简单，收率高，溶媒耗量少，生产周期短，成本低，适合于工业化生产，制得的环孢菌素A纯度高，提高了药品的质量和安全性。

技术领域

本发明涉及药物纯化技术领域，具体涉及一种环孢菌素A粗品的制备方法及其用于高效制备高纯度环孢菌素A的方法。

背景技术

环孢菌素A是一种含有11个氨基酸的环状多肽化合物，是一种作用很强的免疫抑制剂，广泛应用于肾脏、肝脏、心脏和肺等实体器官移植后的抗排异治疗。它还可以用于治疗成人的特应性皮炎，及用来治疗一些自身免疫疾病。

目前，环孢菌素A主要通过微生物发酵的方法获得。发酵完成的发酵液中，除了含有环孢菌素A以外，还含有B、C、D、G、H等其他几种环孢菌素以及培养基成分、各种菌体代谢物等其它杂质。现有技术对环孢菌素A提纯的主要工艺路线为先用有机溶剂提取，然后通过不同类型的柱层析或结合结晶进行分离纯化。

US5656459公开了经特定含量范围的非活性成分组成的培养基静态发酵后，发酵液用甲醇萃取得到一次残留物，一次残留物脱色后经乙酸乙酯萃取得到二次残留物，二次残留物经硅胶柱层析纯化，用正己烷/氯仿/甲醇洗脱得到三次残留物，最后再用树脂柱纯化，甲醇洗脱获得环孢菌素A。该方法经两次常规萃取得到环孢菌素A粗品，柱层析前粗品杂质种类和含量较多，需两次柱层析纯化，且使用毒性较大的氯仿和甲醇做洗脱剂，生产成本高、环境不友好，不适用于工业化生产。

WO20010064935公开了将发酵液用甲醇萃取后，浓缩液中加入明矾搅拌3小时，过滤，滤饼用环己烷溶解，浓缩后得到纯度为59.8％的环孢菌素A粗品，粗品再经凝胶过滤、柱层析和结晶纯化得到环孢菌素A产品。

CN200510108097.9公开了向发酵液中直接加丙酮、过滤，减压浓缩，再用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至干后用丙酮/水/正己烷三相萃取两次，再用丙酮/水于-5℃结晶3天，硅胶60进行柱层析纯化，活性炭脱色，最后在-15℃条件下重结晶得到纯度大于98.5％的产品，总收率55.1％-64.9％。该工艺需多次萃取，其中丙酮/水/正己烷三相萃取时难于分层，使用的硅胶60填料价格昂贵，且第一次结晶需要3天，整个工艺耗时长。

CN200910253905.9公开了一种大孔吸附树脂柱和硅胶柱层析相结合的分离方法。向发酵液中加NaOH溶液调节pH至中性，加入有机溶剂提取环孢菌素A。依次用大孔吸附树脂层析和硅胶柱层析纯化，收集纯度合格的环孢菌素A洗脱液，最后经结晶纯化，获得纯度大于98.5％的成品，总收率65.3-70.1％。该方法需两次柱层析，溶剂用量大，生产成本高，不适合工业化生产。

另有其他数十篇文献公开了环孢菌素A的分离纯化方法。如专利US597638公开了一种利用高压二氧化碳作为流动载体通过硅胶柱层析获得环孢菌素A的方法；《中国抗生素杂志，2008，5，276-280》使用大孔吸附树脂结合高速逆流色谱分离纯化；US5382655公开了一种用氯仿、二氯甲烷和乙醇作为流动相分离纯化环孢菌素A的硅胶柱层析方法等等。

总结现有技术中的分离纯化方法可知，发酵液用有机溶剂萃取后，需经硅胶柱层析联合其他层析或结晶纯化，或使用特殊设备的层析分离才能获得比较高纯度的环孢菌素A。这是因为前期分离提取获得的粗品中含有较多的杂质，如WO20010064935中公开，粗品的纯度为59.8％。现有技术一般采用在发酵液经浸提、萃取后，通过预层析纯化来提高粗品的纯度，但获得的粗品纯度并不理想，市售的环孢菌素A粗品的纯度约为65％，且此时柱层析上样量很低，生产成本高。因此，为了高效获得高纯度的环孢菌素A，开发新的、易于操作的前期纯化工艺，减少杂质含量，利于后续获得高纯度产品，具有非常重要的意义。

发明内容