[发明专利]一种抗稻瘟病基因表达的检测方法及其应用在审
| 申请号： | 201810687226.1 | 申请日： | 2018-06-28 |
| 公开（公告）号： | CN108753937A | 公开（公告）日： | 2018-11-06 |
| 发明（设计）人： | 葛才林;李忠楠;王泽港;陈晟;吴雅萍 | 申请（专利权）人： | 扬州大学 |
| 主分类号： | C12Q1/686 | 分类号： | C12Q1/686;C12Q1/6895 |
| 代理公司： | 南京业腾知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 32321 | 代理人： | 董存壁 |
| 地址： | 225009 江苏省*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 抗稻瘟病基因 水稻材料 抗稻瘟病 内参基因 测试组 琼脂糖凝胶电泳检测 琼脂糖凝胶电泳 稻瘟病 总RNA为模板 表达水平 稻瘟病菌 电泳条带 高度调节 三对引物 有效检测 主效基因 后提取 逆转录 水稻穗 总RNA 检测 颈节 两组 条带 接种 调试 清水 注射 应用 | ||
1.一种抗稻瘟病基因表达的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在水稻孕穗初期选取待测水稻材料，将待测水稻材料按相同数量分为两组，一组作为测试组，进行稻瘟病菌接种处理，另一组作为对照组，穗苞注射1mL清水，7天后提取水稻穗颈节总RNA；
(2)以总RNA为模板，逆转录获得cDNA模板；
(3)以Ubq5为内参基因，设计一对内参引物Ubq5，对内参基因进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物后进行浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳检测，根据内参基因Ubq5的条带高度调节cDNA模板浓度，使测试组水稻材料和对照组水稻材料的cDNA模板浓度一致；
所述内参引物Ubq5的序列为：Ubq5-F：5'-ACCACTTCGACCGCCACTACT-3'，Ubq5-R：5'-ACGCCTAAGCCTGCTGGTT-3'；
(4)设计Pita、Pib、Pikh三对引物，以经浓度调试的cDNA为模板，进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
(5)对步骤(4)的PCR扩增产物进行浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳条带的宽度和亮度来判断待测水稻材料抗稻瘟病还是感稻瘟病。
2.如权利要求1所述的抗稻瘟病基因表达的检测方法，其特征在于，步骤(4)中，
Pita引物的序列为：Pita-F：5'-GTCTTCGGATGTTTGGGAGG-3'，Pita-R：5'-TCAGGCAAACCACGGCTA-3'；
Pib引物的序列为：Pib-F：5'-CGCAAAACAGGACAATCA-3'，Pib-R：5'-TGCATCACCCTTACCCA-3'；
Pikh引物的序列为：Pikh-F：5'-AGCCTTGAAGTCTGGGAACA-3'，Pikh-R：5'-GACCCTCACAGCCTGAAGAA-3'。
3.如权利要求1所述的抗稻瘟病基因表达的检测方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中，所述PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 10μL，ddH2O 7-xμL，cDNA模板xμL，Primer F 1.5μL，Primer R 1.5μL；所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，50-65℃退火15s，72℃延伸45s，循环29～37次，最后72℃延伸10min。
4.如权利要求3所述的抗稻瘟病基因表达的检测方法，其特征在于，步骤(4)中，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸45s，循环35次，最后72℃延伸10min。
5.如权利要求1至4任一项所述的抗稻瘟病基因表达的检测方法，其特征在于，步骤(5)中，琼脂糖凝胶电泳检测的电压为120V，电流为100mA，时间为25min。
6.权利要求1至5任一项所述检测方法在抗稻瘟病水稻材料筛选和鉴定方面的用途。
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