[发明专利]一种抗稻瘟病基因表达的检测方法及其应用在审

专利信息
申请号: 201810687226.1 申请日: 2018-06-28
公开(公告)号: CN108753937A 公开(公告)日: 2018-11-06
发明(设计)人: 葛才林;李忠楠;王泽港;陈晟;吴雅萍 申请(专利权)人: 扬州大学
主分类号: C12Q1/686 分类号: C12Q1/686;C12Q1/6895
代理公司: 南京业腾知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 32321 代理人: 董存壁
地址: 225009 江苏省*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 抗稻瘟病基因 水稻材料 抗稻瘟病 内参基因 测试组 琼脂糖凝胶电泳检测 琼脂糖凝胶电泳 稻瘟病 总RNA为模板 表达水平 稻瘟病菌 电泳条带 高度调节 三对引物 有效检测 主效基因 后提取 逆转录 水稻穗 总RNA 检测 颈节 两组 条带 接种 调试 清水 注射 应用
【说明书】:

发明涉及一种抗稻瘟病基因表达的检测方法,取待测水稻材料按相同数量分为两组,一组为测试组,进行稻瘟病菌接种处理,另一组为对照组,穗苞注射清水,7天后提取水稻穗颈节总RNA;以总RNA为模板,逆转录获得cDNA模板;以Ubq5为内参基因,PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测,根据内参基因Ubq5的条带高度调节cDNA模板浓度,使测试组和对照组水稻材料的cDNA模板浓度一致;设计抗稻瘟病基因Pita、Pib、Pikh三对引物,以经浓度调试的cDNA为模板,PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳,根据电泳条带的宽度和亮度来判断待测水稻材料抗稻瘟病还是感稻瘟病。该方法简单、方便,能有效检测抗稻瘟病主效基因的表达水平。

技术领域

本发明涉及一种抗稻瘟病基因表达的检测方法,属于分子生物学技术领域。

背景技术

稻瘟病由真菌(Mangnaporthe grisea)引起,是水稻主产区面临的极为棘手的病害之一,严重影响水稻的高产稳产。近年来,在全国各稻区稻瘟病持续发生,江苏省也是稻瘟病的高发地区。目前,培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的措施,而鉴定发掘广谱高抗优异抗性资源是培育优良抗稻瘟病水稻品种的关键。但由于稻瘟病菌变异性强,多数抗病基因对瘟病菌生理小种的抗性针对性强,一些抗性品种种植几年就会丧失抗性。这给抗病品种育种带来了严峻的挑战。

相关研究表明,近几年我国通过审定的绝大多数水稻品种含有稻瘟病抗性基因Pita、Pib、Pikm和Pikh(pi54),表明稻瘟病抗性基因Pib、Pita和Pikh是我国目前推广品种中的主要抗病基因。

稻瘟病抗性基因Pib是第一个被克隆的基因,Pib基因属于NBS-LRR类抗病基因。其基因的表达会受到温度、光照等环境因素及水杨酸、茉莉酸、乙烯等化学物质所调节。该基因的cDNA全长4288bp,包含有4个内含子,编码的蛋白产物是由1251个氨基酸组成,该蛋白产物包含一个NBS结构和17个LRR结构,氨基端的NBS区存在激酶1a,2a和3a结构域单位,LRR中部有8个成簇的半胱氨酸残基。由于Pib在感病品种中缺少c23ORF是造成抗感差异的原因。

Pita是一个单拷贝基因,属于NBS-LRR类抗病基因,在水稻抗病品种和感病品种表现出很低的组成型表达。Pita基因的抗病反应是其编码的产物与稻瘟病菌的无毒基因AVR-Pita表达产物相互作用引发的。Pita基因序列包含2个外显子和1个内含子,编码的蛋白产物是由928个氨基酸组成,该蛋白产物含NBS结构域和LRR结构域。抗感品种中的Pita基因的编码产物仅有一个氨基酸的差异,即在抗病产物的第918个氨基酸丙氨酸突变为感病产物的丝氨酸。

稻瘟病抗性位点Pik位于水稻第11染色体长臂近末端区域,包含有5个等位的抗稻瘟病基因,它们分别是Pikh、Pikm、Pik、Pikp和Piks。在水稻品种K3和Tetep中都有存在Pikh基因,该基因对菌株H05-56-1和H02-20-1表现抗性。Pikh基因受稻瘟病菌诱导表达,是一个显性抗稻瘟病基因,且在抗病品种Tetep中的表达量要高于感病品种HP2216中的表达量。在抗病品种Tetep中,Pikh包含1个外显子,编码的蛋白产物是由330个氨基酸组成。比较日本晴和抗病品种中Pikh的序列发现,在感病品种日本晴中,Pikh的RNA剪切位点1017处的A突变成G,从而导致日本晴中产生了212bp的内含子,同时还有30bp序列的插入,以及PolyA中的C突变成T,另外5’-UTR和3’-UTR分别插入了49bp和140bp的序列。

目前对稻瘟病的鉴定包括:稻瘟病菌接种鉴定和抗稻瘟病主效基因组的分子鉴定,但在生产上,经常出现一些抗稻瘟病水稻品种在种植几年后其抗性丧失的现象,这可能和稻瘟病菌生理小种的变异相关;另一方面,一些抗稻瘟病主效基因组成相同的不同水稻材料在经相同稻瘟病菌接种处理后其抗性常常有不同的表现,这可能与抗稻瘟病主效基因的表达相关。目前抗稻瘟病分子鉴定主要是以DNA为模板定性检测水稻中抗性基因的有无及组成,不能鉴定抗稻瘟病主效基因是否表达,因此,非常有必要建立一种能检测多个抗稻瘟病基因(如Pita、Pib与Pikh)表达水平的技术。

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