[发明专利]一种利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法及其产品和应用

权利要求书

1.一种利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，其特征在于该复合膜主要通过以下步骤制备得到：将蛋白、果胶、壳聚糖、增塑剂、表面活性剂溶解于水中共混，加入热稳定重组细菌漆酶，制备得到成膜液，成膜液pH为5.5-6.5，超声脱气，倒入聚四氟乙烯板，60-90℃酶催化交联反应10-20分钟；100℃-120℃灭酶并杀菌处理10-20分钟；控制湿度、温度干燥后揭膜；

其中,成膜液中蛋白含量为6％-8％、果胶含量为1％-2％、壳聚糖含量为1％-2％，增塑剂含量为2％-4％，表面活性剂含量为2％-4％，重组细菌漆酶量为10-20U/100g成膜液；所述的％表示质量百分含量。

2.根据权利要求1所述的利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，其特征在于酶催化交联反应温度为80-90℃。

3.根据权利要求1所述的利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，其特征在于所述的蛋白选自鱼、猪或牛来源的明胶蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，其特征在于所述的增塑剂选自甘油、山梨醇、聚乙二醇中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，其特征在于所述的表面活性剂选自吐温80、司盘、烷基葡糖苷、脂肪酸甘油酯中的任意一种。

6.根据权利要求1所述的利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，其特征在于所述的重组细菌漆酶为热稳定的重组死亡谷芽孢杆菌漆酶，该重组细菌漆酶通过如下方法制备：

(1)以保藏号为CGMCC No.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103基因组DNA为模板，序列为SEQ ID NO.3的上游引物和序列为SEQ ID NO.4的下游引物PCR扩增含有SacI和XhoI酶切位点的漆酶基因序列；

(2)将纯化的上一步PCR产物经SacI、XhoI双酶切后插入载体pET-23a的SacI/XhoI酶切位点之间，获得含有漆酶基因的表达质粒pET-23a-fmb-L103；

(3)将表达质粒pET-23a-fmb-L103转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落,接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜,按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基,35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度100μg/ml)诱导，5小时后离心收集菌体；

(4)将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，4℃，10 000×g离心10min，收集上清液作为粗酶液，将处理得到的粗酶液按照Ni-NTA His Tag Kit说明书进行纯化。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的利用热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜的方法，其特征在于包含如下步骤：将壳聚糖溶解于1wt％的酸溶液中，所述的酸溶液选自盐酸、醋酸、乳酸、苹果酸或柠檬酸中的一种或多种酸溶液；蛋白质、果胶分别通过水溶解；三种溶液混合，加入增塑剂、表面活性剂及重组细菌漆酶得成膜液，成膜液pH用NaOH或HCl溶液调节至5-8，超声脱气后，倒入聚四氟乙烯板，60-90℃酶催化交联反应10-20分钟；100℃-120℃灭酶并杀菌处理10-20分钟；控制湿度RH30％-50％、温度20-30℃，干燥12-18h揭膜。

8.按照权利要求1-6中任一项所述的方法制备的热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜。

9.权利要求8所述的热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜在食品保鲜中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于将权利要求8所述的热稳定重组细菌漆酶制备蛋白/多糖复合膜包裹果蔬、肉制品，达到保鲜效果；或将成膜液直接涂于果蔬、肉制品表面，达到保鲜效果。