[发明专利]一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法

说明书

本发明公开了一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，包括喹啉基花菁类衍生物(CyQ)的制备、荧光探针(CyQ‑Cys)溶液的制备、金属选择性实验、Fe³⁺的检测测试、黑茶备用液的制取、黑茶备用液测试等步骤。本发明以4‑甲基喹啉与二醛缩合剂反应得到喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，随后，喹啉基花菁类衍生物(CyQ)与半胱氨酸(Cys)通过卤素‑巯基亲核取代和重排反应得到荧光探针(CyQ‑Cys)，而铁离子(Fe³⁺)可诱导荧光探针(CyQ‑Cys)荧光信号明显增强，其荧光信号的变化与Fe³⁺浓度呈良好的线性关系，且荧光探针(CyQ‑Cys)可快速(＜30s)、高特异性识别Fe³⁺而不受常见离子的干扰。

技术领域

本发明涉及黑茶抗氧化领域，尤其涉及一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法。

背景技术

黑茶中的黄酮、儿茶素等抗氧化性物质能有效抑制活性氧的形成，具有良好的抗氧化活性，其测定方法主要有清除自由基能力法、氧化自由基吸收能力法及铁离子还原法。其中，Fe³⁺被抗氧化剂还原为Fe²⁺后，通过与三吡啶三嗪(TPTZ)络合引起吸光度的变化来检测抗氧化活性，但分光光度法的灵敏度偏低。因此，改进铁离子还原法，发展一种高灵敏、高特异性的荧光分析法检测黑茶的抗氧化活性将具有非常重要的意义。

另一方面，金属离子可与生物硫醇如谷胱甘肽(GSH)及半胱氨酸 (Cys)分子中的羧基、氨基和巯基配位，通过改变检测体系的光学信号，实现对金属离子的检测，有效的利用上述原理可高选择性、快速识别Fe3+而不受Fe2+的干扰。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，具体包括以下步骤：

S1、4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)的制备：将4-甲基-N-乙基喹啉，N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐及无水醋酸钠溶于乙醇中，在氮气保护下于80℃反应 1h，冷却后，旋蒸除溶剂，然后在氯仿和醋酸钠溶液中搅拌1h，过滤，真空干燥，柱层析分离，得到4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，便于后续的使用；

S2、荧光探针(CyQ-Cys)溶液的制备：4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)用N，N-二甲基甲酰胺配成10mol/L溶液，半胱氨酸 (Cys)用去离子水配成200mmol/L溶液，在离心管中依次加入 10mol/L的4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)溶液，逐滴加入200mmol/L的半胱氨酸(Cys)溶液，10mmol/L、pH值为7的磷酸缓冲盐溶液，混合均匀后用N，N-二甲基甲酰胺稀释，反应3min，随后，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化，通过卤素-巯基亲核取代和重排反应得到荧光探针(CyQ-Cys)母液；

S3、金属选择性实验：金属盐用去离子水配成1.0mmol/L溶液备用。在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ-Cys)溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同量的不同金属离子溶液，反应3min 后，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号变化，检测荧光探针(CyQ-Cys)用于Fe³⁺的特异性响应，Fe³⁺与其它金属离子共存时，荧光探针(CyQ-Cys)的抗干扰能力；

S4、Fe³⁺的检测测试：在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针 (CyQ-Cys)溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同浓度的Fe³⁺溶液，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化，检测不同浓度的Fe³⁺溶液荧光强度相应的变化情况；