[发明专利]一种人源视网膜色素上皮细胞的程序性降温冻存的方法及应用在审
| 申请号： | 201810694183.X | 申请日： | 2018-06-29 |
| 公开（公告）号： | CN109864063A | 公开（公告）日： | 2019-06-11 |
| 发明（设计）人： | 方攀峰;张俊克;范国平;王云娟 | 申请（专利权）人： | 江苏艾尔康生物医药科技有限公司 |
| 主分类号： | A01N1/02 | 分类号： | A01N1/02;C12N5/079 |
| 代理公司： | 上海麦其知识产权代理事务所(普通合伙) 31257 | 代理人： | 董红曼 |
| 地址： | 214028 江苏省无锡市新*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 冻存 视网膜色素上皮细胞 人源 降温程序 冻存管 降温仪 老年黄斑变性 生物医学技术 长期保存 酶消化法 消化处理 冻存液 分装 重悬 成熟 冷冻 损伤 细胞 疾病 治疗 应用 | ||
1.一种人源视网膜色素上皮细胞的冻存方法，其特征在于，所述冻存方法包括如下步骤：
(1)成熟RPE细胞的消化处理：对培养成熟的人源视网膜色素上皮细胞RPE细胞采用酶消化法进行收集，计数，用冻存液重悬细胞，分装至冻存管；
(2)将所述冻存管转移至程序性降温仪中进行冷冻冻存；
(3)获得目的产物即冻存的人源视网膜色素上皮细胞；
其中，步骤(2)中，所述冷冻冻存的程序包括第一阶段：
以1.0℃-2.0℃/分的速率降温直至样品温度达到-5.0℃～-10℃；
以25.0℃-40.0℃/分的速率降温直至腔室温度达到-40.0℃～-60.0℃。
2.如权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述酶消化法中采用的消化酶包括胰酶、胶原酶、胰蛋白酶的替代酶、中性蛋白酶。
3.如权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述消化时间为10-30min；或，当所述酶消化法中采用的消化酶为胰蛋白酶的替代酶，则消化时间为10-20min；或当所述酶消化法中采用的消化酶为中性蛋白酶，则消化时间为13-30min。
4.如权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述冻存液为(体积百分比)：含10％二甲基亚砜(DMSO)的胎牛血清(FBS)或血小板裂解液(HPL)、间充质干细胞专用冻存液、Cryo-SFM冻存液、CryoStor CS10 Freeze Media之一种。
5.如权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述冻存液的配方为(体积百分比)：90％血小板裂解液HPL-A和10％二甲基亚砜DMSO。
6.如权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述步骤(2)中，在第一阶段完成之后，所述冷冻冻存的程序继续进行第二阶段：
以10.0℃/分的速率升温直至腔室温度达到-12.0℃；
以1.0℃/分的速率降温直至腔室温度达到-40.0℃；
以10.0℃/分的速率降温直至腔室温度达到-80.0℃；
结束。
7.如权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述冷冻冻存的程序为程序1.2，所述程序1.2为：
等待4.0℃
以1.0℃/分的速率降温直至样品温度达到-6.0℃；
以25.0℃/分的速率降温直至腔室温度达到-40.0℃；
以10.0℃/分的速率升温直至腔室温度达到-12.0℃；
以1.0℃/分的速率降温直至腔室温度达到-40.0℃；
以10.0℃/分的速率降温直至腔室温度达到-80.0℃；
结束。
8.按如权利要求1-7之任一项所述的冻存方法得到的冻存的人源视网膜色素上皮细胞。
9.如权利要求8所述的冻存的人源视网膜色素上皮细胞在用于制备治疗RPE损伤疾病的药物或作为细胞治疗RPE损伤疾病的细胞资源中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病包括年龄相关性黄斑变性ARMD、Stargardt黄斑营养不良SMD、帕金森氏综合症。
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