[发明专利]一种人源视网膜色素上皮细胞的程序性降温冻存的方法及应用

说明书

本发明公开了一种人源视网膜色素上皮细胞(RPE)的程序性降温冻存的方法，属于生物医学技术领域。所述方法包括：(1)成熟RPE细胞的消化处理：对培养成熟的人源视网膜色素上皮细胞RPE细胞采用酶消化法进行收集，计数，用冻存液重悬细胞，分装至冻存管；(2)将所述冻存管转移至程序性降温仪中进行冷冻冻存；(3)获得冻存的人源视网膜色素上皮细胞。本发明方法通过使用程序性降温仪按特定的降温程序对人源视网膜色素上皮细胞进行冻存。本发明利用不同降温程序冻存RPE细胞，进而摸索最佳的冻存程序。本发明提供的人源视网膜色素上皮细胞的冻存方法为短期或者长期保存，以及今后使用的RPE细胞治疗AMD(老年黄斑变性)等RPE损伤疾病提供了新来源。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种人源视网膜色素上皮细胞(RPE)的程序性降温冻存的方法及应用。

背景技术

RPE是位于视网膜外部的连续单层细胞，因其筛子状的形态和胞质内丰富的黑色素而得名，它们在视网膜细胞的维持和自我更新上发挥重要功能，如：吞噬消化脱落的光感受器细胞的OS；促进视循环中重要的介质11-顺视黄醛的再生；调节眼内的免疫反应；参与形成视网膜-血管屏障等。RPE细胞的这一生理功能异常被认为与相关眼科疾病的发生密切相关，如RPE细胞屏障功能异常则易导致Best卵黄样黄斑营养不良(Bestvitelliformmacular dystrophy，BVMD)和成人卵黄样黄斑营养不良(adult-onsetvitelliformmacular dystrophy，AVMD)。RPE基底膜与Bruch＇s membrane之间的连接或功能异常被认为与年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)和Sorsby’s眼底营养不良的发生相关。

AMD主要表现为视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜吞噬消化能力下降，结果使未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排除沉积于Bruch膜，形成玻璃膜疣。AMD分为干性和湿性两种，其中，干性AMD更为常见，它是由于RPE进行性营养不良造成的脉络膜毛细血管和光受体缺失的一种疾病。湿性AMD的典型特征是有脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)生成，从而造成严重的视力丧失。除了细胞替代治疗，目前尚无逆转这一退行性过程并回复视力的有效办法。

RPE细胞治疗AMD的试验显示通过在视网膜下腔移植正常RPE细胞，能够延缓进行性的视觉功能丧失。RPE细胞移植在RPE遗传缺陷动物模型和AMD病人上的试验，都显示能够延缓视网膜的退行性病变，改善视觉功能。RPE细胞在视网膜下腔的自体移植比较稳定，且具有长期的疗效。

细胞冻存是细胞生物学技术中一个非常重要的方法手段，传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。后来出现了程序性降温盒，细胞冻存管置于程序性降温盒中可以直接置于-80℃冰箱，过夜即可转移到液氮中。但是由于这两种方式的降温速率无法监控，且-80℃冰箱温度也会有波动，造成不同时间冻存的细胞之间差异很大，为此出现了程序性降温仪，该仪器可以做到根据细胞的类型自己设置冻存程序，控制细胞降温的速率，并且可以实时监控冻存过程，这样可以保证不同批间细胞冻存效果的均一性。程序性降温仪已经在众多细胞冻存中得到了应用，但是由于RPE细胞的特殊性，目前还没有专门针对冻存RPE细胞的程序被报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，针对RPE细胞的个体较小，冻存密度高等特殊性，针对冻存曲线中的潜热点进行了位置摸索，最终确定了最佳的冻存程序，本发明提供的冻存异体RPE细胞的方法，为长期保存有活力的RPE细胞，治疗AMD等RPE损伤疾病提供了充足的细胞资源。

本发明提供了一种人源视网膜色素上皮细胞的冻存方法，所述冻存方法包括如下步骤：