[发明专利]产2;5-呋喃二甲酸重组基因工程菌的固定化及其应用

说明书

本发明涉及产2,5‑呋喃二甲酸重组基因工程菌的固定化及其应用，用超分子自组装模板固定大肠杆菌表达的2,5‑呋喃二甲酸重组基因工程菌。重组基因工程菌的构建，是将梭菌属甘油脱水酶基因gldABC，整合进土生克雷伯杆菌基因dhaβ,形成重组DNA基因gldha；通过PCR扩增，并经修饰后插入大肠杆菌表达载体pTE28aT7，构建2,5‑呋喃二甲酸重组基因工程菌pTE28aT7‑gldha；超分子自组装模板，是将硅酸钠、十六烷基三甲基溴化胺、氯化铵和三氯化铝在水相和超分子自组装条件下，制备的孔径为20～35nm的超大比表面积（不小于1000m²/g）的模板。

技术领域：本发明属于微生物发酵技术，涉及产2,5-呋喃二甲酸重组基因工程菌的固定化及其应用。

背景技术

2,5-呋喃二甲酸( FDCA) 是重要的有机合成中间体，可用来制备各种烷基取代或酯类呋喃衍生物。烷基取代类衍生物广泛应用于合成手性催化剂、分子识别受体和高分子材料中; 酯类衍生物是重要香料，主要用在食品、化妆品香精中。此外，2,5-呋喃二甲酸可取代对苯二甲酸制造聚酯类的塑胶材料。在药理学方面，2,5-呋喃二甲酸二乙酯具有与可卡因类似的麻醉作用，2,5-呋喃二甲酸钙盐具有抑制巨大芽孢杆菌的生长的功能。

以二甘醇酸为原料，与二氯亚砜和甲醇反应得到二甘醇酸二甲酯，在氢氧化钾作用下，与二水合三聚乙二醛缩合得到2,5-呋喃二甲酸。此法原料不易制备、价格昂贵，合成中用到了二氯亚砜、乙醚、氯仿等危险试剂，后处理常采用柱层析法， 不利于工业化生产。以5-羟甲基糠醛为原料，二氧化铈为催化剂，高压(1.01×10⁶Pa)氧化得到2,5-呋喃二甲酸。此法虽然获得较好的收率99%，但原料及催化剂价格昂贵，高压条件对设备要求太高，工业化成本高，不利于实际生产应用。以糠酸为起始原料，先与甲醇反应，经氯甲基化，再水解，最后经高锰酸钾氧化制得2,5-呋喃二甲酸 ，反应总收率为47.5% 。此方法的原料虽较廉价易得，但操作工艺要求高和环境污染较严重。本发明是将梭菌属甘油脱水酶基因gldABC，整合进土生克雷伯杆菌基因dhaβ,形成重组DNA基因gldha；通过PCR扩增，并经修饰后插入大肠杆菌表达载体pTE28aT7,构建2,5-呋喃二甲酸工程菌pTE28aT7-gldha；在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下，采用超分子自组装模板固定化，在含有果糖的限制培养基中，经深度发酵合成2,5-呋喃二甲酸；通过过滤发酵液、有机溶剂萃取结晶和组合溶剂重结晶,获得产品2,5-呋喃二甲酸。合成工艺路线简捷，既节能又环保，所获得的产品质量高和成本低，总质量收率达到65.5%以上。

随着固定化酶技术的发展，越来越多的研究者关注于固定化大肠杆菌酶。固定化大肠杆菌酶具有如下优势：相较于游离酶，固定化酶在催化反应过程中，其质粒更加稳定，目的基因产物活力较高，产物易于分离纯化。自1959年Hattori首次将大肠杆菌酶吸附在树脂上实现了大肠杆菌酶固定化以来，固定大肠杆菌活酶或称为固定化增殖大肠杆菌酶的研究工作相继展开。

超分子通常是指由两种或两种以上分子依靠分子间相互作用结合在一起，组成复杂的、有组织的聚集体，并保持一定的完整性使其具有明确的微观结构和宏观特性。人们可以根据超分子自组装原则，使用分子间的相互作用力作为工具，把具有特定的结构和功能的组分或建筑模块,按照一定的方式组装成新的超分子化合物。这些新的化合物不仅仅能表现出单个分子所不具备的特有性质，还能大大增加化合物的种类和数目。如果人们能够很好的控制超分子自组装过程，就可以按照预期目标更简单、更可靠的得到具有特定结构和功能的化合物。本发明，将硅酸钠、十六烷基三甲基溴化胺、氯化铵和三氯化铝在水相和超分子自组装条件下，制备的孔径为20～35nm的超大比表面积（不小于1000m²/g）的超分子自组装模板。将上述超分子自组装模板，采用物理吸附法用来固定上述重组基因工程菌，并用于在含果糖限制性培养基中发酵制备2,5-呋喃二甲酸。本发明的固定化菌株，产物表达量最高可达130g/L，果糖转化率高于65.5%；重复利用性好，重复利用30次后，产物表达量仍可达105g/L，果糖转化率高于52.90%，将对2,5-呋喃二甲酸的微生物发酵制备具有积极的作用，应用前景广阔。