[发明专利]基于双重PCR对大麦抗黄矮病基因Yd2的分子标记辅助选择方法及专用引物

权利要求书

1.一种基于双重PCR对大麦抗黄矮病基因Yd2的分子标记辅助选择专用引物，其特征在于，所述引物为两对特异引物对MYM和MYP，引物对MYM的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，其反向引物序列如SEQ ID No.2所示，引物对MYP的正向引物序列如SEQ ID No.3所示，其反向引物序列如SEQ ID No.4所示。

2.一种基于双重PCR对大麦抗黄矮病基因Yd2的分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)提取待检测大麦各育种世代材料的基因组DNA；

(2)以待测大麦材料的基因组DNA为模板，利用与大麦Yd2基因紧密连锁的2个分子标记设计出的2对特异引物对MYM和MYP，进行双重PCR扩增与电泳检测；

(3)根据双重PCR产物电泳检测结果中152bp、100bp、111bp三种条带的出现情况，判定大麦材料是否携带Yd2基因，并直接确定其Yd2基因型；

(4)按照步骤(1)～(3)的方法检测育种分离世代个体后，根据判定的Yd2基因型结果对其各世代分离群体加以选择。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述双重PCR扩增的反应体系为：扩增反应总体积为10μL，含20～50ng大麦模板DNA或者DNA粗提液，1×PCR buffer，0.24mmol L^-1dNTP，1.5mmol L^-1MgCl₂，1.5U Taq DNA聚合酶，MYP标记上下游引物各0.2μmolL^-1，MYM标记上下游引物各0.6μmol L^-1；

所述双重PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环；最后总延伸5min，4℃保温。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述双重PCR扩增所用引物对的浓度比例为：MYP引物对/MYM引物对＝1/3。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述双重PCR产物的电泳检测方法为：采用2.0％～2.3％琼脂糖凝胶进行电泳检测，样品与不含指示剂的上样缓冲液混合后点样；DNA Marker与含指示剂的上样缓冲液混合点样，作为电泳参照物，电泳结束后，凝胶经EB浸泡染色，最后用紫外凝胶成像仪观察电泳结果并拍照。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述大麦材料是否携带Yd2基因，并直接确定其Yd2基因型的具体判断方法为：

①若为152bp+100bp带型，可判定携带Yd2基因，其基因型为Yd2⁺/Yd2⁺；

②若为152bp+100bp+111bp带型，则判定携带Yd2基因，其基因型为Yd2⁺/Yd2^-；

③若只出现111bp条带，则不含Yd2基因，其基因型为Yd2^-/Yd2^-。